張偉 畢揚(yáng) 趙丹 宗召莉 郭巍

（1. 北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071001）

幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和圍食膜的重要組成成分，幾丁質(zhì)代謝隨昆蟲不同生長(zhǎng)發(fā)育階段而變化，對(duì)昆蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要［1］，參與幾丁質(zhì)代謝的酶是殺蟲劑破壞昆蟲生長(zhǎng)機(jī)制的潛在靶標(biāo)。幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA）是昆蟲幾丁質(zhì)代謝酶系中的重要組成，可催化幾丁質(zhì)脫乙?；纬蓺ぞ厶牵?］。目前，對(duì)多種昆蟲CDA蛋白功能研究表明，昆蟲CDA類蛋白與昆蟲蛻皮、羽化以及氣管延伸等方面有關(guān)，為昆蟲防治提供了有利依據(jù)。

昆 蟲CDA蛋 白 分 為CDAⅠ、CDAⅡ、CDAⅢ、CDAⅣ及CDAⅤ五大類［3］。CDAⅠ類蛋白包含幾丁質(zhì)脫乙?；复呋瘏^(qū)結(jié)構(gòu)域（CDA）、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ChBD）以及低密度脂蛋白結(jié)合區(qū)（LDLa），CDAⅡ類蛋白結(jié)構(gòu)域與第Ⅰ類的結(jié)構(gòu)域一致，但是序列差異大，研究表明，赤擬谷盜（Tribolium castaneum）TcCDA1與TcCDA2與其蛻皮和羽化有關(guān)［4］；飛 蝗（Locusta migratoria）LmCDA1、LmCDA2a 和LmCDA2b在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)，并具有不同的幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性［5］；CDAⅢ類蛋白和CDAⅣ類蛋白都具有CDA與ChBD結(jié)構(gòu)域，不含有LDLa結(jié)構(gòu)域，但是第Ⅲ類和第Ⅳ類CDA的結(jié)構(gòu)域在CDA上的位置存在較大程度差異；CDAⅤ類蛋白只含有CDA結(jié)構(gòu)域，不具有ChBD 與LDLa結(jié)構(gòu)域，CDAⅤ類蛋白研究中，粉紋夜蛾CDA研究表明，TnPM-P42蛋白具有很強(qiáng)的幾丁質(zhì)結(jié)合活性，與圍食膜結(jié)合緊密［6］，蓓帶夜蛾CDA的研究結(jié)果推測(cè)CDA的作用可能是參與改變圍食膜中幾丁質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，而這一生化活動(dòng)對(duì)圍食膜蛋白的結(jié)合程度、圍食膜的完整性和孔隙率產(chǎn)生影響［7］。在黑腹果蠅中，克隆得到2個(gè)能編碼具有典型CDA功能域的CDA，通過氣管上幾丁質(zhì)的脫乙?；拗茪夤苎娱L(zhǎng)［8］。赤擬谷盜第Ⅴ類CDA蛋白在中腸內(nèi)特異性表達(dá)，利用RNA干擾技術(shù)對(duì)昆蟲CDA表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，干擾昆蟲正常生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝過程以及抵抗病原物的特性［9］。幾丁質(zhì)代謝隨昆蟲不同生長(zhǎng)發(fā)育階段而變化，對(duì)昆蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，因此，通過破壞幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)或幾丁質(zhì)代謝的平衡來防治害蟲具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner），屬鱗翅目、夜蛾科，是以危害蔬菜為主的雜食性害蟲［10］。本研究克隆甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶secda7基因，體外表達(dá)的SeCDA7蛋白進(jìn)行幾丁質(zhì)結(jié)合活性分析，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析secda7基因轉(zhuǎn)錄水平在不同組織的表達(dá)，為明確深入探究昆蟲幾丁質(zhì)脫乙酰酶的生理功能奠定理論基礎(chǔ)，為甜菜夜蛾生物防治提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx與細(xì)胞培養(yǎng) 甜菜夜蛾為北京農(nóng)學(xué)院植保系農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室利用人工氣候箱飼養(yǎng)；草地貪夜蛾昆蟲細(xì)胞系（Sf9）為北京農(nóng)學(xué)院植保系農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室27℃培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、載體與菌株 質(zhì)粒pMD19-T、pET-30a（帶有His標(biāo)簽）和pFastBac HT A（帶有His標(biāo)簽）以及E.coliDH5α、BL21、JM109和E.coliDH10BacTM菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自Promega公司；LA Taq酶、SYBR Premix Ex TaqTM購自Takara公司；RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；Mouse anti-6×His tag monoclonal antibody、Goat Anti-Mouse lgG（H+L）、NI-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自康為試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 甜菜夜蛾secda7基因的克隆及序列分析 根據(jù)甜菜夜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)secda7全長(zhǎng)基因引物（表1）。提取甜菜夜蛾四齡幼蟲中腸RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以secda7 F和secda7 R為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶cDNA序列片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接pMD19-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行雙酶切鑒定后序列測(cè)定，并對(duì)secda7基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用DNAMAN軟件分析其開放閱讀框及其氨基酸序列，NCBI Blast進(jìn)行功能域分析，使用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，用NetNGlyc1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測(cè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。

1.2.2secda7基因的原核表達(dá) 設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物ySecda7 F和ySecda7 R進(jìn)行secda7基因的克?。ū?），將secda7與pET-30a原核表達(dá)載體使用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定正確的陽性克隆于28℃培養(yǎng)時(shí)，分別加入不同濃度（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L、1.25 mmol/L）的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別利用第一抗體小鼠抗6×His單克隆抗體（Mouse anti-6×His tag monoclonal antibody）（1∶5 000）和第二抗體山羊抗小鼠IgG（Goat Anti-Mouse lgG）（1∶20 000） 抗 體 進(jìn) 行Western blot分析SeCDA7重組蛋白的表達(dá)。

1.2.3secda7基因的真核表達(dá) 設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物zSecda7 F和zSecda7 F進(jìn)行secda7基因的克隆（表1），將secda7與pFastbac HTA真核表達(dá)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastbac HTA-secda7轉(zhuǎn)化DH10 BacTM感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白板篩選方法篩選陽性克隆。鑒定正確重組Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，收集P3代病毒上清，分別利用第一抗體小鼠抗6×His單克隆抗體（Mouse anti-6×His tag monoclonal antibody）（1∶5 000）和第二抗體山羊抗小鼠IgG（Goat Anti-Mouse lgG）（1∶20 000）抗體進(jìn)行Western blot分析SeCDA7重組蛋白的表達(dá)。

1.2.4secda7基因在甜菜夜蛾各組織中的表達(dá)分析 分別取甜菜夜蛾卵及預(yù)蛹，并將四齡甜菜夜蛾于冰上進(jìn)行解剖，提取頭、表皮、中腸、圍食膜、馬氏管、脂肪體和蛻皮，利用RNeasy Mini Kit試劑盒（QIAGEN）提取總RNA，測(cè)定濃度后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo Scientific）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)secda7基因相關(guān)熒光定量引物qSecda7 F和qSecda7 R（表1），以及以β-action為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），參照Takara SYBR Premin Ex TaqTMⅡ說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。利用相對(duì)定量公式2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 重組蛋白SeCDA7幾丁質(zhì)結(jié)合活性分析 通過Molano等［11］及Li等［12］的方法制備再生幾丁質(zhì)，將10 g脫乙酰幾丁質(zhì)粉末溶于350 mL 10%的乙酸，室溫過夜，次日，加入900 mL甲醇，利用玻璃纖維過濾后加入20 mL乙酸酐成凝膠狀，靜置30 min，用抹刀切片搗碎，用ddH2O洗至pH7.0。

表1 secda7基因全長(zhǎng)引物及熒光定量引物

取1 mL純化后（利用NI-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化）的重組SeCDA7蛋白與400 mg再生幾丁質(zhì)在離心管中加入1 mmol/L PMSF室溫溫育，混勻后4℃過夜。次日，12 000 r/min離心3 min，棄上清，用1×PBS清洗2次，收集沉淀。將所得絡(luò)合物分別與PBS、2%SDS、2%SDS+5%β-巰基乙醇、0.5 mol/L氯化鈉、2%熒光增白劑和6 mol/L尿素室溫溫育15 min，離心后收集上清進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 secda7全長(zhǎng)基因的獲得及序列分析

通過RT-PCR方法克隆得到編碼甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶secda7基因。序列分析結(jié)果（圖1）顯示，secda7基因（GanBank登錄號(hào)為MG604929）全長(zhǎng)1 431 bp，開放閱讀框?yàn)? 134 bp，編碼378個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的SeCDA7蛋白的分子量和等電點(diǎn)約為43.156 kD和5.20。SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號(hào)肽分析顯示，在17和18氨基酸位點(diǎn)之間存在一個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)；NetNGlyc 1.0 Server軟件預(yù)測(cè)77和169氨基酸處存在兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)；結(jié)構(gòu)域分析表明SeCDA7具有一個(gè)多聚糖乙?；D(zhuǎn)移酶催化區(qū)（氨基酸52-322位），屬于第Ⅴ類CDA蛋白。其氨基酸序列與鱗翅目昆蟲蓓帶夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶（GenBank登錄號(hào)HM357864）具有較高的相似性。

2.2 重組SeCDA7的原核表達(dá)

圖1 secda7基因cDNA序列及推測(cè)的氨基酸序列

2.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建secda7基因與pET-30a載體連接轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建重組菌株DH5α（pET-30a-secda7），經(jīng)雙酶切鑒定，獲得5 422 bp載體和1 134 bp目的基因條帶，證明成功構(gòu)建目的基因的原核表達(dá)載體，結(jié)果見圖2。原核表達(dá)載體的成功構(gòu)建，可使攜帶外源核酸序列的重組載體進(jìn)入大腸桿菌中進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。

圖2 原核重組表達(dá)載體酶切鑒定結(jié)果

2.2.2 重組SeCDA7在大腸桿菌中的表達(dá) 用終濃度為1.25 mmol/L的IPTG在28℃對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)2、4、6、8 h取樣，收集菌體沉淀進(jìn)行檢測(cè)。Western blot 分析重組SeCDA7蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，結(jié)果見圖3，在28℃，用1.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h SeCDA7蛋白表達(dá)量最高，蛋白大小約為47 kD。

圖3 SeCDA7的SDS-PAGE及Western Blot表達(dá)圖譜

2.3 重組SeCDA7的真核表達(dá)

2.3.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將secda7基因與pFastbac HTA載體連接轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建重組菌株JM109（pFastbac HTA-secda7），瓊脂糖凝膠電泳（圖4）顯示，出現(xiàn)4 776 bp載體大小條帶和1 134 bp目的基因大小條帶，證明成功構(gòu)建目的基因的真核表達(dá)載體。將重組pFastbac HTA-secda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選得到重組Bacmid質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定，得到3 564 bp大小的條帶，表明成功得到重組Bacmid質(zhì)粒。

2.3.2 重組SeCDA7在Sf9昆蟲細(xì)胞的表達(dá) 將重組Bacmid轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9昆蟲細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞出現(xiàn)明顯感染癥狀，細(xì)胞直徑和細(xì)胞核增大，視野中出現(xiàn)顆粒體（圖5），得到P3代病毒培養(yǎng)72 h時(shí)，Western blot分析（圖6）顯示SeCDA7在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)大小約為47 kD的目的蛋白。

2.4 secda7基因在甜菜夜蛾各組織中的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果（圖7）顯示，secda7基因在甜菜夜蛾的卵、預(yù)蛹、頭、表皮、中腸、馬氏管及脂肪體中有表達(dá)，但是表達(dá)量較低，在中腸中表達(dá)量最高，為中腸特異性表達(dá)蛋白。

圖4 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體的鑒定

圖5 重組病毒轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞狀態(tài)比較（10×）

圖6 SeCDA7表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

2.5 SeCDA7幾丁質(zhì)結(jié)合活性測(cè)定

外源表達(dá)的SeCDA7蛋白表現(xiàn)出幾丁質(zhì)結(jié)合活性，與鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾Tn-P42蛋白類似，在體外與幾丁質(zhì)可緊密結(jié)合，Western blot分析結(jié)果（圖8）顯示，SeCDA7蛋白僅用強(qiáng)洗脫劑2%SDS+5%β-巰基乙醇和6 mol/L尿素以及2%熒光增白劑可將其洗脫，而用PBS、2%SDS、0.5 mol/L氯化鈉不能將其洗脫。

圖7 secda7基因在甜菜夜蛾不同組織中的表達(dá)模式

圖8 SeCDA7重組蛋白幾丁質(zhì)結(jié)合活性Western blot分析

3 討論

昆蟲幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA）是昆蟲體內(nèi)一類重要幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，可分布在蟲體內(nèi)多個(gè)含幾丁質(zhì)成分組織結(jié)構(gòu)中，是幾丁質(zhì)降解酶系成員之一，能夠催化幾丁質(zhì)中β-1，4糖苷鍵連接的N-乙?；咸前返囊阴０坊?，將幾丁質(zhì)修飾為殼聚糖，在昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝中具有重要作用［13-15］。從2005年以來，研究者從不同的昆蟲中開始探索CDA類蛋白的生物功能，這對(duì)昆蟲生物防治具有重要生物學(xué)意義。

SeCDA7蛋白成功在大腸桿菌中表達(dá)，有利于研究蛋白純化、定位及功能分析。利用pFastBac HT A載體使得SeCDA7蛋白成功在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行純化與表達(dá)分析，并鑒定出SeCDA7蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性，這與粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）［6］、華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblitaFaldermann）［16］第Ⅴ類CDA蛋白表現(xiàn)的幾丁質(zhì)結(jié)合活性相一致。通過熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)secda7基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的組織定位，屬于中腸特異蛋白，這與第Ⅴ類CDA蛋白功能具有直接相關(guān)性。

SeCDA7蛋白屬于昆蟲中腸特異蛋白，圍食膜作為昆蟲體內(nèi)抵御外源性物質(zhì)的第一道天然屏障，具有保護(hù)中腸上皮細(xì)胞，阻止病原物的侵染等多種功能，圍食膜主要由蛋白質(zhì)、多糖和幾丁質(zhì)構(gòu)成，其中蛋白質(zhì)對(duì)于維持圍食膜的致密結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，推測(cè)第Ⅴ類CDA蛋白與圍食膜結(jié)構(gòu)功能緊密相關(guān)，因此圍食膜蛋白是進(jìn)行害蟲防治重要的切入點(diǎn)之一。對(duì)幾丁質(zhì)脫乙酰酶功能的研究不只局限于昆蟲中，在一些真菌、細(xì)菌及蟹類、魚類等海洋生物都有相關(guān)研究報(bào)道。在尼杜拉曲霉、苜蓿中華根瘤菌、構(gòu)巢曲霉和稻瘟病菌中也分離得到不同幾丁質(zhì)脫乙酰酶類［17-20］，參與不同的生理功能；在線蟲中，也得到了幾丁質(zhì)脫乙酰酶類蛋白［21］，在對(duì)藥材甲蟲的研究中，表明SpCDA1對(duì)于S. paniceum中幼蟲到蛹轉(zhuǎn)變是必不可少的［22］，在對(duì)紅雪蟹的研究中，僅在表皮中發(fā)現(xiàn)CDA存在，推測(cè)可能與蛻皮相關(guān)［23］。幾丁質(zhì)脫乙酰酶類蛋白的廣泛研究，明確幾丁質(zhì)脫乙酰酶類蛋白在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及深入探究幾丁質(zhì)脫乙酰酶的生理功能也顯得尤為重要。

4 結(jié)論

克隆了甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶secda7全長(zhǎng)基因，在原核和真核中表達(dá)約47 kD的蛋白，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示SeCDA7含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，屬于第Ⅴ類CDA蛋白，Western Blot分析結(jié)果顯示SeCDA7蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性，熒光定量PCR結(jié)果表明secda7基因?qū)儆谥心c特異蛋白。