華穎，茅佩卿，劉柱*

1(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州，310053) 2(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州，310052)

氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate，EC，也可稱作Urethane)[1]，常伴隨發(fā)酵過程產(chǎn)生，在發(fā)酵酒中含量較高。EC是一種已被證實(shí)的致癌物[2-3]，且乙醇可以促進(jìn)其致癌性。2007年，世界衛(wèi)生組織(World Trade Organization, WTO)將EC歸類為可能會(huì)造成人類患癌癥的2A組之中[4]。

黃酒作為我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品和民族特產(chǎn)，是世界上最古老的酒種之一，與葡萄酒、啤酒并稱為世界三大古酒[5]。因生產(chǎn)過程涉及特殊的發(fā)酵工藝，EC存在于黃酒、葡萄酒、啤酒等釀造酒[6-7]和食用酒精中，而食用酒精又被廣泛用于配制酒、白酒等產(chǎn)品中，是目前我國(guó)酒類生產(chǎn)中使用最為廣泛的原料。因此，研究黃酒和食用酒精中EC含量測(cè)定，掌握其中EC的含量水平，促進(jìn)酒類行業(yè)的健康發(fā)展，一直是科研機(jī)構(gòu)的研究重點(diǎn)[8]。

已報(bào)道的黃酒及食用酒精中氨基甲酸乙酯的測(cè)定方法有分光光度法、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[9]、薄層色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[10]。分光光度計(jì)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速，但易受其他雜質(zhì)干擾，而高效液相色譜法的前處理操作復(fù)雜繁瑣，成本昂貴。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法不但擁有氣本色譜法(gas chromatography,GC)的高效能分離，而且還擁有了質(zhì)譜法(mass spertrometry, MS)的高效能鑒別。它可以從復(fù)雜的基質(zhì)中靈敏地測(cè)定某一特定的組分，因此氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前使用較多的測(cè)定酒精飲料中氨基甲酸乙酯的方法[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)在參考大量相關(guān)文獻(xiàn)及反復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用GC-MS法測(cè)定黃酒和食用酒精中的氨基甲酸乙酯[14-17]。本方法使用堿性硅藻土固相萃取柱凈化、濃縮后，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。本方法的建立，有效提高了黃酒和食用酒精中氨基甲酸乙酯的檢測(cè)效率和技術(shù)水平，為其他酒類中EC的測(cè)定提供技術(shù)參考，有效促進(jìn)不同酒類中氨基甲酸乙酯限定標(biāo)準(zhǔn)的制定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

GCMS-TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；QT-1渦旋混勻器，上海琪特分析儀器有限公司；Turbo VapO LV全自動(dòng)氮吹濃縮儀，美國(guó)Biotage公司；WAT200609固相萃取裝置(配真空泵)，美國(guó)Waters公司；KH-500DV數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；P330馬弗爐，德國(guó)納博熱公司；XPE205天平(可讀性0.01 mg)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑

實(shí)驗(yàn)所用樣品：黃酒樣品為上海老酒，產(chǎn)自浙江省紹興市；食用酒精，產(chǎn)自西安食用酒精廠。

Na2SO4(分析純)，450 ℃烘烤4 h，冷卻后貯存于干燥器中備用；NaCl(分析純)；正己烷、乙醚、甲醇(色譜純)；以上試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(C3H7O2N，CAS51-79-6)：購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司(純度大于99.0%)；D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(C3H2D5NO2，CAS73962-07-9)：購(gòu)自甄淮生物科技有限公司(純度>98.0%)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.000 01 g)氨基甲酸乙酯對(duì)照品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存；使用時(shí)用甲醇稀釋為1.0和0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.000 01 g)D5-氨基甲酸乙酯對(duì)照品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000.0 mg/L的同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存；使用時(shí)用甲醇稀釋為1.0 mg/L同位素內(nèi)標(biāo)工作液。

分別精密移取20、40、80、120、240、600、1 200 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.0 mg/L)置2.0 mL容量瓶中，再分別精密加入200 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液(1.0 mg/L)，用甲醇定容，得到10、20、40、60、120、300、600 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm, 0.25 μm)；載氣：He，流速1 mL/min；進(jìn)口樣柱溫：220 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL； 溶劑延遲：11 min，傳輸線溫度：250 ℃；升溫程序：初溫50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，程序運(yùn)行完后，240 ℃后運(yùn)行5 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電子轟擊源(EI)；能量為70 eV；四級(jí)桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；檢測(cè)方式：選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)；氨基甲酸乙酯選擇監(jiān)測(cè)離子(m/z):44、62、74、89[15]，定量離子62；D5-氨基甲酸乙酯選擇監(jiān)測(cè)離子(m/z)：64、76，定量離子64。

1.4 前處理操作

酒類樣品搖勻，稱取2 g(精確至0.000 1 g)，加入100 μL D5-氨基甲酸乙酯工作液(1.0 mg/L)，混勻后再加入0.3 g NaCl，超聲溶解，在抽真空條件下，將樣品溶液緩慢加入堿性硅藻土固相萃取柱中，靜置10 min，經(jīng)10 mL正己烷淋洗后，用10 mL乙酸乙酯-乙醚(95∶5)以約1 mL/min流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，并經(jīng)2 g Na2SO4脫水后，35 ℃下用N2緩緩吹至近干，用甲醇定容至1.0 mL，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后，供GC-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的選擇

GC-MS法用于酒類中氨基甲酸乙酯檢測(cè)的研究已有文獻(xiàn)[18-22]報(bào)道，本文參考已發(fā)表文獻(xiàn)，并進(jìn)一步優(yōu)化。由于EC含有的氨基具有較高的極性，故選擇極性色譜柱HP-INNOWAX(30 m×250 μm，0.25 μm)，并且在優(yōu)化后的色譜條件下EC可獲得較好的峰形、較高的靈敏度和分離度，雜質(zhì)干擾少，結(jié)果如對(duì)照品色譜圖1和樣品色譜圖5所示。在電子電離源條件下(70 eV)，通過對(duì)D5-EC和EC標(biāo)準(zhǔn)品的分析，獲得EC靈敏度和選擇性較好的選擇特征碎片離子(m/z) 62、44、74，如圖2。

圖1 EC及D5-EC的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatography of EC and D5-EC

圖2 氨基甲酸乙酯質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of EC

通過對(duì)EC可能的裂解途徑分析，氮帶正電荷的自由基離子會(huì)發(fā)生α斷裂生成m/z44碎片離子，或經(jīng)過氫自由基遷移、逆鍬爾斯-阿爾德反應(yīng)(Diels-Alder reaction)重排后生成m/z62碎片離子，可以通過N-C-O的共軛系統(tǒng)穩(wěn)定正離子，所以理論上m/z62碎片離子具有最高的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，所以選擇m/z62作為定量離子。獲得D5-EC靈敏度和選擇性較好的選擇特征碎片離子m/z64、76，選擇對(duì)應(yīng)的m/z64作為定量離子。

2.2 前處理的優(yōu)化

本文主要研究對(duì)象是中國(guó)特色酒類—黃酒，而已報(bào)到文獻(xiàn)的研究對(duì)象主要為白酒[18-21]或果酒、飲料[16-17, 22]。黃酒主要用糯米發(fā)酵，含有糊精、麥芽糖、葡萄糖、脂類,甘油、高級(jí)醇、維生素及有機(jī)酸等，基質(zhì)非常復(fù)雜，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)基質(zhì)效應(yīng)明顯，定性、定量準(zhǔn)確性差，所以需要采用相應(yīng)的前處理技術(shù)進(jìn)行凈化。

在前處理方面，為了所研制方法的普適性，本研究采用的是較為通用型堿性硅藻土固相萃取柱[23]，進(jìn)一步考察淋洗液、洗脫液和靜置時(shí)間對(duì)回收率的影響。而王健等[18]和徐躍成等[22]都采用的固定品牌的專用固相萃取柱(cleanert EC-SPE，購(gòu)于Agela，4 g/25 mL)， 因?yàn)榘拙茖儆谡麴s酒，酒精含量高，基質(zhì)成分簡(jiǎn)單，上樣后可以直接用二氯甲烷洗脫，白酒甚至不用前處理就可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析；但對(duì)于黃酒來說，該方法很難達(dá)到比較好的凈化效果，況且二氯甲烷的毒性較強(qiáng)。出于以上原因本文研究了便于所有實(shí)驗(yàn)室使用的通用型堿性硅藻土固相萃取柱在黃酒中氨基甲酸乙酯檢測(cè)中的應(yīng)用，與蘇占元等[19]的研究相比，簡(jiǎn)化了“洗脫液再經(jīng)過填有2 mL N-丙基乙二胺固相吸附劑(primany secondary amine,PSA)填料柱凈化”的前處理步驟。

2.2.1 淋洗液對(duì)EC回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響

正己烷和環(huán)己烷在性質(zhì)上雖然沒有太大差異，但兩種物質(zhì)的極性差異明顯，因此作為淋洗液時(shí)，對(duì)黃酒中部分物質(zhì)的去除能力不同，因此考察環(huán)己烷、正己烷2種淋洗液對(duì)回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)己烷和正己烷均不會(huì)將EC從固相萃取柱上洗脫下來。進(jìn)一步研究環(huán)己烷和正己烷的淋洗除雜效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷和環(huán)己烷作為淋洗液時(shí)都有一定程度的除雜效果，如圖4和圖5所示，與未經(jīng)過固相萃取凈化處理的黃酒樣品的檢測(cè)結(jié)果(圖3)相比，雖然環(huán)己烷和正己烷均有一定的除雜效果，但以正己烷作為淋洗液時(shí)基質(zhì)干擾較少。因此本研究選擇10 mL正己烷作為淋洗液。

圖3 未經(jīng)過固相萃取凈化處理的黃酒樣品色譜圖Fig.3 Chromatographic charts of yellow rice wine samples without solid phase extraction and purification

圖4 經(jīng)過環(huán)己烷淋洗固相萃取凈化處理的黃酒樣品色譜圖Fig.4 Chromatographic charts of yellow rice wine samples purified by solid phase extraction aftercyclohexane elution

圖5 經(jīng)過正己烷淋洗固相萃取凈化處理的黃酒樣品色譜圖Fig.5 Chromatographic charts of yellow rice wine samples purified by solid phase extraction after n-hexane elution

2.2.2 洗脫液對(duì)EC回收率的影響

分別選擇乙酸乙酯和含有5%、10%、30%、50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醚的乙酸乙酯溶液10 mL，以約1 mL/min流速進(jìn)行洗脫。其余條件不變，按照樣1.4前處理操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，回收率結(jié)果如表1所示。

表1 不同洗脫液條件下的回收率Table 1 Recovery of differenteluents

(1)

2.2.3 不同靜置時(shí)間對(duì)EC回收率的影響

由圖 3可知，揚(yáng)稻 6號(hào)（Ghd7－EZ18）株系中的1個(gè)株系（C1312）同對(duì)照揚(yáng)稻6號(hào)的抽穗期進(jìn)行對(duì)比，表現(xiàn)了揚(yáng)稻6號(hào)（Ghd7－EZ18）株系同對(duì)照揚(yáng)稻6號(hào)之間播始?xì)v期的差異。在圖3A中，株系C1312的穗部基本抽出時(shí)，揚(yáng)稻6號(hào)仍處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，尚未抽穗；在圖3B中，揚(yáng)稻6號(hào)穗部剛開始抽出時(shí)，株系C1312已經(jīng)結(jié)束灌漿，進(jìn)入蠟熟期。

按照1.4前處理操作所述，酒類樣品搖勻，稱取2 g(精確至0.000 1 g)，加入100 μL D5-EC工作液(1.0 mg/L)，混勻后再加入0.3 g NaCl，超聲溶解，在抽真空條件下，將樣品溶液緩慢加入堿性硅藻土固相萃取柱中，進(jìn)行靜置處理。

將樣品分別靜置1、5、10、15、20、30 min，用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙酸乙酯-乙醚溶液洗脫，其余條件不變，按照樣品前處理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，隨著靜置時(shí)間的推移，中EC的回收率逐漸增高，當(dāng)靜置時(shí)間大于10 min，回收率幾乎沒有變化。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

按照本研究建立的方法對(duì)“1.2.2”所述的系列標(biāo)準(zhǔn)溶進(jìn)行檢測(cè)，以D5-EC作為同位素內(nèi)標(biāo)，以待測(cè)物質(zhì)的峰面積和相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示，得到線性回歸方程Y=0.004 41X+0.002 834，r2=0.999 3。結(jié)果表明EC在10～600 μg/L線性關(guān)系良好。

圖6 不同靜置時(shí)間對(duì)EC回收率的影響Fig.6 Effect on EC recovery of different standing time

分別在2 g黃酒和2 g食用酒精樣品中(每種樣品各2份)，分別加入40 μL氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.1 μg/mL)，理論加標(biāo)濃度為2.0 μg/kg，再加入100 μL D5-EC標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.4前處理操作后，分別用甲醇定容至1.00 mL，過0.45 μm有機(jī)濾膜，供GC-MS分析，S/N的檢測(cè)結(jié)果見表2。每個(gè)檢出限加標(biāo)都采用3倍的信噪比計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果表明，3倍S/N的檢測(cè)濃度在0.10～0.15 μg/kg，由于受到前處理方式、儀器設(shè)備條件和基質(zhì)效應(yīng)的影響，本方法取1.0 μg/kg作為方法檢出限，3.0 μg/kg作為本方法的定量限，結(jié)果表明，本方法的檢出限與相關(guān)報(bào)道基本一致[23-25]，可滿足檢測(cè)需求。

表2 方法的線性范圍、檢出限和定量限Table 2 The linear range, detection limit and quantitative limit of the method

2.3.2 方法的回收率和精密度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可靠性，在陰性樣品黃酒和食用酒精中分別加入EC標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.0 mg/L)，加標(biāo)水平為5、100和250 μg/kg，每個(gè)濃度水平按照優(yōu)化后的方法平行測(cè)試6次，回收率和RSD的計(jì)算結(jié)果見表3。結(jié)果表明，EC在黃酒中的回收率為81.2%～89.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～5.0%，在食用酒精中的回收率為91.2%～99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～4.1%，本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可以滿足黃酒和食用酒精中EC檢測(cè)的要求。

2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)抽取市場(chǎng)在售的20個(gè)品牌的不同規(guī)格、不同等級(jí)的黃酒和20個(gè)不同企業(yè)生產(chǎn)的食用酒精，按照本實(shí)驗(yàn)建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果保留3位有效數(shù)字，結(jié)果見表4。

表3 方法的精密度和回收率(n=6)Table 3 Recovery and precision of the method

表4 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of EC determined insumple food

注：“-”表示無。

通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黃酒中基本都含有不同濃度的EC，EC檢測(cè)出率為90%，其中含量超過100 μg/kg的有10批，占總抽樣量的50%，含量最高的第17號(hào)黃酒樣品的檢測(cè)結(jié)果為267 μg/kg。說明本實(shí)驗(yàn)建立的黃酒中EC的檢測(cè)方法符合實(shí)際檢測(cè)的需要，檢出限和定量限能滿足實(shí)際檢測(cè)要求，本方法制定的線性范圍符合實(shí)際檢測(cè)的需要，也說明黃酒中普遍含有一定濃度的EC，所以建議黃酒生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)該改進(jìn)和規(guī)范生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步控制黃酒中EC濃度，同時(shí)也為監(jiān)管部門制定黃酒中EC含量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。通過表4中食用酒精樣品的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于食用酒精的生產(chǎn)原料和工藝不同于黃酒，所以食用酒精中EC的檢出率為70%，較黃酒低，另外含量超過100 μg/kg的食用酒精只有4批，占總抽樣批次的20%，含量最高的16號(hào)食用酒精樣品的檢測(cè)結(jié)果為157 μg/kg，說明本研究建立的方法同樣適用于食用酒精中EC的檢測(cè)，也說明部分食用酒精中含有一定濃度的EC，為監(jiān)管部門制定食用酒精中EC含量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用黃酒和食用酒精為研究對(duì)象，建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)快速測(cè)定黃酒和食用酒精中氨基甲酸乙酯含量。樣品經(jīng)過堿性硅藻土固相萃取柱凈化、濃縮后，用GC-MS進(jìn)行測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。在優(yōu)化的條件下，對(duì)EC的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、精密度和檢出限進(jìn)行考察。結(jié)果表明氨基甲酸乙酯在10～600 μg/L線性關(guān)系良好，r2=0.999 3。 當(dāng)加標(biāo)水平為5、100和250 μg/kg時(shí)，黃酒的加標(biāo)回收率為81.2%～89.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.7%～5.0%。食用酒精的加標(biāo)回收率為91.2%～99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.1%～4.1%，方法檢出限為1.0 μg/kg，定量限為3.0 μg/kg。利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)市場(chǎng)在售的20批黃酒和20批食用酒精樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法符合黃酒和食用酒精樣品中EC的檢測(cè)需要，檢出限和定量限能滿足實(shí)際檢測(cè)要求，本方法制定的線性范圍符合實(shí)際檢測(cè)的需要，該方法定量準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于黃酒和食用酒精中氨基甲酸乙酯的測(cè)定。