向凡舒，折米娜，何萌，廖華，趙慧君，郭壯,3*

1(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽，441053)2(恩施市農(nóng)業(yè)局，湖北 恩施，445000) 3(恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施，445000)

米酒又被稱為酒釀、醪糟或甜酒，是一種以糯米為主要原料，通過酒曲等多種微生物的相互作用發(fā)酵而成的發(fā)酵酒[1]，盛行于湖北、海南、陜西以及廣西等地。目前關(guān)于米酒的研究主要集中在理化性質(zhì)分析[2]、滋味品質(zhì)評價[3]、發(fā)酵工藝優(yōu)化[4]和新產(chǎn)品研發(fā)[5]等方面，同時部分研究人員對米酒的微生物組成進行了探討，李福榮[6]對信陽市售米酒中的微生物進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Saccharomycescerivisiae為優(yōu)勢菌，同時還有少量的根霉菌和細菌。焦晶凱[7]利用傳統(tǒng)分離方法在米酒中分離出Lactobacillusplantarum，Lactobacillusrhamnosus，Enterococcussp.，Saccharomycescerevisiae以及Pichiakudriavzevii。然而關(guān)于恩施地區(qū)米酒中細菌多樣性的研究報道尚少。

近年來，由于傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)方法耗時長和工作量大，更快更便捷的分子生物學(xué)手段逐漸被人們所開發(fā)利用。變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)是一種用來研究各種環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)演化的技術(shù)，也是一種識別和分類微生物的工具[8]，廣泛應(yīng)用于醋[9]、白酒[10]、干酪[11]、腌菜[12]和牛肉[13]微生物群落結(jié)構(gòu)的揭示。較之其他二代高通量測序技術(shù)，Illumina MiSeq平臺獲得的高通量序列可以降低成本并增加了每個樣品的測序深度，同時具有測序量大和精確度高等特點[14]，目前在水質(zhì)監(jiān)測[15]、植物飼料[16]、發(fā)酵食品[17]、土壤環(huán)境[18]和動物腸道[19]微生物多樣性解析領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

本研究以采集自湖北恩施土家族苗族自治州的米酒為研究對象，采用DGGE與MiSeq高通量測序相結(jié)合的手段對其微生物多樣性進行了研究，同時對蘊藏的乳酸菌進行了分離鑒定。通過本研究的開展，在對恩施地區(qū)米酒中細菌進行全面解析的同時，也可為米酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒：采集自湖北省恩施土家族苗族自治州的農(nóng)戶家中，所有樣品均使用農(nóng)家自制米酒曲發(fā)酵而成，發(fā)酵時間3～7d。

三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、過硫酸銨、四甲基乙二胺、乙醇、冰乙酸、甲醛、AgNO3、NaOH、CaCO3,國藥集團化學(xué)試劑有限公司；MRS合成培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy Mericon Food Kit宏基因組提取試劑盒,德國QIAGEN公司；DNA marker、PCR清潔試劑盒,京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2PCR×mix,南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTP MIX和pMD18-T,大連寶生物技術(shù)有限公司；DGGE擴增用引物ALL-GC-V3F/ALL-V3R、正向含有7個核苷酸標簽(barcode)的MiSeq測序用引物338F/806R、乳酸菌鑒定用引物27F/1495R、鑒定陽性克隆用引物M13F(-47)/M13R(-48),武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

Veriti PCR擴增儀,美國AB公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度計,美國NanoDrop公司；DCodeTMSystem，美國Bio-Rad公司；DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；MiSeq PE300高通量測序平臺，美國Illumina公司；R920機架式服務(wù)器，美國DELL公司；CT15RE冷凍離心機，日本HITACHI公司；Bio-5000 plus掃描儀，上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站，英國DWS公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡,日本NIKON公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 米酒中微生物宏基因組DNA提取

參照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒使用說明提取10 個米酒樣品中(用MJ1～MJ10表示)微生物的宏基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，并使用NanoDrop檢測其濃度。

1.2.2 PCR擴增米酒樣品細菌16S rRNA基因片段

將各樣品宏基因組DNA濃度做適當稀釋并確定濃度一致，使用帶有GC夾的正向引物ALL-GC-V3F(5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)和反向引物ALL-V3R(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)對樣品DNA的V3區(qū)域進行16S rRNA PCR擴增。擴增體系為25 μL(μL)：10×PCR buffer 2.5，dNTP mix 2，ALL-GC-V3F 0.5，ALL-V3R 0.5，DNA模板量2，rTaq酶 0.5，ddH2O 17。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30 個循環(huán)，72 ℃完全延伸 10 min。 PCR擴增結(jié)束后，用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.3 DGGE分析

將上述檢測合格PCR擴增產(chǎn)物作為模板進行DGGE凝膠電泳。使用8%聚丙烯酰胺凝膠，上層膠為0%變性劑，下層膠為35%～65%梯度變性劑。電泳條件：溫度為60 ℃，電泳緩沖液為0.5 TAE，點樣量為10 μL，先120 V，78 min，使PCR擴增產(chǎn)物快速通過上層膠，后80 V，13 h。

1.2.4 DGGE優(yōu)勢條帶分析

電泳結(jié)束后對凝膠進行AgNO3染色，找出特異性條帶并進行回收、擴增、清潔、連接、轉(zhuǎn)化和克隆鑒定，篩選出陽性克隆子送往武漢天一輝遠生物有限公司進行測序。測序結(jié)果使用Bio Edit軟件將序列進行拼接，并在NCBI Blast中比對查詢。

1.2.5 米酒中細菌16S rRNA PCR擴增和MiSeq高通量測序

參照沈馨等方法[20]，將1.2.1中樣品總DNA作為模板進行16S rRNA PCR擴增。擴增體系：5×PCR buffer 4 μL，dNTP Mix 2 μL，338F和806R各0.5 μL，rTaq酶 0.4 μL，DNA模板 10 ng，ddH2O 12.6 μL。其中引物序列為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)/806R(5’-GGACTACHVGGGT-3’)。擴增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次，72 ℃完全延伸10 min。其擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq測序。

1.2.6 序列拼接和質(zhì)量控制

參照王玉榮等方法[21]，對MiSeq高通量下機序列進行拼接和質(zhì)量控制。首先去除不合格序列，包括堿基數(shù)<50 bp、堿基錯配比率>0.2、barcode存在堿基錯配和引物錯配堿基數(shù)>2 bp的序列，其次去除barcode和引物序列，將剩余序列合并為一個文件以完成后續(xù)分析。

1.2.7 生物信息學(xué)分析

參照王玉榮等方法[22]，使用QIIME分析平臺對序列進行生物信息學(xué)分析。在將各序列校準對齊后，使用UCLUST兩步法歸并建立操作分類單元(operation taxonomic unit，OTU)。選出代表性序列在Greengenes數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，確定各OTU的種屬地位，同時利用Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)評價微生物菌群的豐度和多樣性。

1.2.8 米酒中乳酸菌的分離與純化

使用倍比稀釋涂布的方法，將各樣品稀釋液均勻的涂布于MRS(含質(zhì)量分數(shù)為1.2%～1.5%CaCO3)固體培養(yǎng)基上，置于DG250厭氧工作站中(85%N2，5%CO2及10%H2)，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑選具有透明圈且形狀大小不一的特征菌落進行劃線純化2～3次，將革蘭氏染色為陽性且過氧化氫酶試驗為陰性的菌落進行保存。

1.2.9 米酒中乳酸菌的鑒定

提取各純化菌株DNA，參考張曉輝等[23]的方法使用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1495R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)進行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物進行檢測、清潔、連接、轉(zhuǎn)化和克隆鑒定，篩選出陽性克隆子送往武漢天一輝遠生物有限公司進行測序。測序結(jié)果使用Bio Edit軟件將序列進行拼接，并在NCBI Blast中比對查詢。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Bio Edit軟件和MEGA 5.0軟件采用比鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Origin 8.5軟件對MiSeq高通量測序結(jié)果中優(yōu)勢門相對含量、優(yōu)勢屬相對含量和OTU出現(xiàn)次數(shù)進行繪圖。使用Matlab 2010b軟件繪制核心OTU相對含量的熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 米酒中細菌PCR-DGGE分析

本研究首先將10 個米酒樣品中細菌16S rRNA V3片段進行PCR-DGGE分析，電泳圖譜如圖1所示。

圖1 米酒中細菌PCR-DGGE圖譜Fig.1 PCR-DGGE analysis of bacteria in rice wine samples

由圖1可知，在電泳圖譜中共發(fā)現(xiàn)10 條特征性條帶。其中條帶1、2、3和8存在于每個樣品中，但是亮度卻不一致，說明各樣品中存在相同的細菌但是豐度卻不相同。條帶5存在于MJ1、MJ2、MJ4、MJ7和MJ10樣品中且亮度不同，條帶4、6和7僅存在于MJ5樣品中，條帶9和10僅在MJ1和MJ3中沒有表現(xiàn)出來。由圖1可知，10 條特異性條帶在MJ5樣品中均有較高的亮度，說明MJ5樣品中細菌群落組成具有較高多樣性且各條帶代表的豐度較高，而MJ3樣品中僅存在4條特異性條帶且亮度較暗，說明MJ3樣品細菌群落組成少且豐度較低。進一步將各條帶所代表的序列進行同源性比對，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，條帶1隸屬于Weissella，條帶2隸屬于Enterococcus，條帶3、8和10隸屬于Pediococcus，條帶4、6和7隸屬于Kosakonia，同時條帶5和9隸屬于Lactobacillus。本試驗進一步采用Neighbor-Joining(鄰接法)對上述特征條帶序列與數(shù)據(jù)庫中16S rRNA模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示。

表1 DGGE指紋圖譜中條帶比對結(jié)果Table 1 The blast results of bands in DGGE fingerprint of rice wine

圖2 DGGE指紋圖譜中條帶系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bands in DGGE fingerprint

由圖2可知，系統(tǒng)發(fā)育樹被分為兩大分支，其中條帶4、6和7聚類在一個分支上，其余條帶聚類在另一分支，同時發(fā)現(xiàn)各條帶菌株代表的序列與模式菌株具有較高的相似度。值得一提的是，本研究使用引物ALL-GC-V3F/ALL-V3R，以16S rRNA的V3區(qū)為擴增靶點對細菌的多樣性進行解析，然而V3區(qū)序列長度較短，為了結(jié)果準確性，本研究僅將鑒定結(jié)果明確至屬水平。張振東等在16 個來源不同的米酒樣品中發(fā)現(xiàn)Enterococcus、Streptococcus、Lactobacillus、Pediococcus以及Weissella存在于所有米酒樣品中，證明了米酒樣品中細菌多樣性較高[24]。苗乘源等利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法相結(jié)合的手段對朝鮮傳統(tǒng)米酒中的菌株進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lactobacillusfermentum參與米酒發(fā)酵的整個過程[25]。相飛采用PCR-DGGE技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)甜酒曲中存在Weissellakimchi、Enterococcusfaecium和Herbaspirillumsp.等細菌[26]。上述3個研究的結(jié)論與本研究基本一致。

2.2 米酒中細菌MiSeq高通量測序分析

為了克服DGGE技術(shù)通量低的不足，本研究進一步使用MiSeq高通量測序技術(shù)對10 個米酒樣品的細菌多樣性進行了分析，其16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量如表2所示。

表2 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 2 16S rRNA read counts and the number of identifiable units on different taxonomical levels

由表2可知，10 個米酒樣品中共產(chǎn)生575 616 條序列，平均每個樣品產(chǎn)生57 562 條序列。本試驗首先根據(jù)序列的100%相似性歸類獲得123 817 條具有代表性的序列，根據(jù)97%相似性歸類共得到7 147 個OTU，平均每個樣品715 個OTU。當測序量為52 010 條序列時，MJ5樣品的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)達到最大值，分別為1 110和5.64，說明此時MJ5樣品中細菌群落豐富度和多樣性均為最高，這與DGGE結(jié)果一致。

納入本研究的序列被鑒定為27 個門，80 個綱，122 個目，173 個科，285 個屬，僅有1.98%和8.75%未鑒定到門和屬水平。米酒中平均相對含量>1%的門如圖3所示。

圖3 米酒中優(yōu)勢細菌門相對含量分析Fig.3 Analysis of relative abundance of dominant bacterial in rice wine samples at the phylum level

由圖3可知，10 個米酒樣品中平均相對含量>1%的門分別為Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes，其平均相對含量分別為81.53%、13.03%和2.78%。進一步分析發(fā)現(xiàn)Firmicutes在樣品MJ6、MJ8和MJ9中較高，相對含量分別為99.84%、99.26%和99.34%，Proteobacteria在樣品MJ5中較高，相對含量為87.69%。本研究進一步在屬水平上對各樣品的細菌多樣性進行了分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 米酒中優(yōu)勢細菌屬相對含量分析Fig.4 Analysis of relative abundance of dominant bacterial in rice wine samples at the genus level

由圖4可知，10 個米酒樣品中共有5個細菌屬的平均相對含量>1%，分別為Pediococcus、Enterococcus、Weissella、Kosakonia和Prevotella，其平均相對含量分別為58.03%、10.72%、8.24%、3.34%和2.01%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Pediococcus為樣品MJ3、MJ4、MJ6、MJ7、MJ8和MJ9中含量最多的細菌，相對含量分別為76.32%、89.50%、88.02%、93.71%、93.31%和96.72%。Pediococcus和Prevotella為MJ1中的優(yōu)勢細菌屬，相對含量分別為21.35%和19.87%；Enterococcus、Weissella和Kosakonia分別為樣品MJ1、MJ10和MJ5中含量最多的細菌，相對含量分別為97.56%、67.79% 和33.32%。有研究人員亦采用高通量測序技術(shù)對米酒曲中的細菌多樣性進行了解析。采用單分子實時測序技術(shù)，韓琬對3個日本米酒曲樣品的細菌多樣性進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)米酒曲中的細菌主要隸屬于Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Verrucomicrobia，而Proteobacteria為優(yōu)勢細菌門[27]。利用MiSeq高通量測序的方法，沈馨等在3個孝感鳳窩酒曲中發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢細菌屬為隸屬于Firmicutes的Weissella、Enterococcus、Lactococcus和Bacillus細菌屬[20]。值得一提的是，MJ1和MJ5樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)與其他8個樣品存在較大的差異，究其原因可能與使用酒曲種類、制作環(huán)境或制作工藝有關(guān)。

本研究進一步統(tǒng)計了OTU在10 個米酒樣品中出現(xiàn)次數(shù)及相對含量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 OTU出現(xiàn)次數(shù)與其包含序列的相對含量Fig.5 Occurrence frequency and the sequence numbers included of OTU

本研究共產(chǎn)生7 147 個OTU，由圖5可知，僅出現(xiàn)1次的OTU為6 008 個，占OTU總數(shù)的84.06%，但其序列僅占總序列數(shù)的4.15%。值得注意的是,出現(xiàn)10 次的OTU有6個，僅占OTU總數(shù)的0.08%，而序列數(shù)占總序列的58.72%。本研究進一步對核心OTU的相對含量進行了分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 核心OTU相對含量分析Fig.6 Analysis of relative abundance of core OTUs

由圖6可知，6 個核心OTU分別為OTU5645，OTU59、OTU6688、OTU1966、OTU4807和OTU447，其平均相對含量分別為54.74%、0.80%、0.76%、0.33%、0.30%和0.10%。由于第二代高通量測序不能鑒定到種水平，只能確定其細菌屬。進一步分析發(fā)現(xiàn)OTU5646隸屬于Pediococcus，OTU59隸屬于Ralstonia，OTU6688隸屬于Herbaspirillum，OTU1966隸屬于Acinetobacter，OTU4807隸屬于Burkholderia和OTU447隸屬于Pseudomonas。由此可見，Pediococcus為恩施地區(qū)米酒樣品中的優(yōu)勢細菌。

2.3 米酒中乳酸菌菌株的分離與鑒定

本研究進一步對米酒中的乳酸菌進行了分離鑒定，并將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的模式菌株構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7所示。

圖7 米酒中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of Lactobacillus in rice wine samples

由圖7可知，在米酒中共分離鑒定出17 株乳酸菌，其中有11 株鑒定為Pediococcuspentosaceus，2 株鑒定為Enterococcusfaecium，2 株鑒定為Weissellaconfusa，1 株鑒定為Lactobacillusbrevis，1 株鑒定為Lactobacillusplantarum。由此可知，恩施地區(qū)米酒中的優(yōu)勢乳酸菌為Pediococcuspentosaceus，這與PCR-DGGE及MiSeq高通量測序結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究以恩施地區(qū)米酒為研究對象，利用PCR-DGGE與MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合的手段對其細菌多樣性進行了解析，研究發(fā)現(xiàn)Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes為恩施地區(qū)米酒中的優(yōu)勢細菌門，Pediococcus、Enterococcus、Weissella、Kosakonia和Prevotella為恩施地區(qū)米酒中的優(yōu)勢細菌屬。此外，恩施地區(qū)米酒中乳酸菌亦具有較高的多樣性，且以Pediococcuspentosaceus為主。