陳宇凌，陳銀元，劉安倩，李文，李同祥，王陶

(江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室(徐州工程學(xué)院)，江蘇 徐州，221018)

近年來(lái)，重金屬污染引起的食品安全問(wèn)題已成為人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)[1-2]。在所有重金屬污染問(wèn)題中，鎘因其生物毒性大、移動(dòng)性強(qiáng)成為最受關(guān)注的對(duì)象之一[3]。鎘是一種蓄積性十分強(qiáng)的重金屬元素，即便處于很低的濃度，一旦蓄積起來(lái)，會(huì)對(duì)人體和其他生物造成危害[4]。鎘雖然在通常情況下含量低，但還可以通過(guò)食物鏈來(lái)富集而達(dá)到高濃度。食品中鎘的存在形態(tài)主要與蛋白質(zhì)、脂類和多糖等形成螯合配體[5-7]。由于環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和食品加工問(wèn)題等，常常會(huì)引起食品中鎘的污染。因此，對(duì)食物中鎘的去除和吸附研究就至關(guān)重要。

傳統(tǒng)處理重金屬的方法有很多，如膜分離法、電解法、沉淀法等，但這些方法也呈現(xiàn)出成本高、技術(shù)要求高、釋放副產(chǎn)物、對(duì)環(huán)境造成二次污染等問(wèn)題[8-9]。近年來(lái)，生物吸附法引起了人們的高度重視，生物吸附法具有高效、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。生物吸附是指利用生物材料去除重金屬，利用吸附劑與金屬離子發(fā)生物理或化學(xué)反應(yīng)，而生物材料劃分為微生物材料、植物材料和動(dòng)物材料[10-11]。其中，微生物具有繁殖快、代謝旺、易培養(yǎng)、成本低的優(yōu)勢(shì)，因此，其在重金屬吸附中具有獨(dú)特地位[12-13]。乳酸菌作為食品安全級(jí)別的益生菌，能夠通過(guò)離子交換、物理吸附、胞內(nèi)擴(kuò)散等方式吸附鎘[14]，是很好的鎘污染防治菌株?？蓪⑵渥鳛殒k的吸附劑添加到鎘污染的食品中去，移除食品中的鎘[15-18]；或者作為膳食補(bǔ)充劑攝入到體內(nèi)，使其在腸道內(nèi)吸附鎘，再通過(guò)糞便將鎘排出體外[19-20]，防止鎘在體內(nèi)積累。KINOSHITA等[21]從牛腸、豬腸、日式泡菜、日本甘酒、韓國(guó)泡菜和酸奶中分離出了包括乳酸桿菌、鏈球菌、腸球菌等103株乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行了吸附研究，發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌都具有良好鎘吸附能力。目前，雖有篩選得到能耐受一定鎘濃度的乳酸菌株，但這些菌株仍存在耐鎘和/或吸附鎘的能力不強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定性不高，菌體生長(zhǎng)及吸附條件窄等諸多不足，高耐鎘乳酸菌種資源的挖掘工作還有待于進(jìn)一步進(jìn)行。

因此，本研究擬從四川自制泡菜汁中篩選出乳酸菌，通過(guò)含不同濃度的鎘培養(yǎng)基馴化乳酸菌，從而得到耐鎘最高的菌株，對(duì)此菌株進(jìn)行初步鑒定，并進(jìn)一步研究其吸附鎘及其他重金屬的性能，為乳酸菌株治理食品中重金屬鎘及其他重金屬污染奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川萬(wàn)源自釀泡菜汁；CdCl2·2H2O、MnSO4、CuSO4·5H2O、吐溫-80(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PbSO4(分析純)，阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；酸度計(jì)，上海市羲精密儀器有限公司；生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；A3AFG-13原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 MRS培養(yǎng)基

(1)MRS液體培養(yǎng)基配制方法(g/L)：葡萄糖20.0、牛肉浸膏 15.0、酵母浸膏5.0、蛋白胨10.0、無(wú)水乙酸鈉5.0、檸檬酸氫二銨2.0、KH2PO42.62、MnSO4·4H2O 0.198、MgSO4·7H2O 0.58、吐溫-80 1.0 mL，無(wú)菌水1 000 mL，pH 6.0～6.5，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

(2)MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂粉。

1.3.2 高鎘培養(yǎng)基

在MRS固體/液體培養(yǎng)基中按所需濃度加入相應(yīng)CdCl2·2H2O。

1.4 耐鎘乳酸菌株的富集、篩選及耐鎘能力

1.4.1 乳酸菌株的初篩

將四川自釀食用泡菜汁原液，稀釋成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，將10-4，10-5，10-6泡菜稀釋液取100 μL至已凝固好的含Cd2+質(zhì)量濃度為50 mg/L 的MRS固體培養(yǎng)基上，用滅過(guò)菌的涂布棒將稀釋液反復(fù)涂布至均勻，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d。

1.4.2 乳酸菌株的復(fù)篩

將初篩出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)，復(fù)篩出接觸酶試驗(yàn)陰性，革蘭氏陽(yáng)性菌株，作為下一步耐鎘馴化的菌株。

1.4.3 高耐鎘乳酸菌株的富集、篩選與遺傳穩(wěn)定性

將復(fù)篩出的菌株分別轉(zhuǎn)移接種到Cd2+質(zhì)量濃度更高的250、400、500、1 300、2 000、4 000、6 000、10 000、11 000 mg/L 的固體培養(yǎng)基和100、300、500、600、800、900、1 000 mg/L的液體培養(yǎng)基中，觀察其生長(zhǎng)狀況，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行，對(duì)篩選出的高耐隔菌株分別在最高耐受濃度的固體和液體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10代，觀察其生長(zhǎng)和耐隔情況。

1.5 耐鎘乳酸菌的鑒定

1.5.1 菌落形態(tài)觀察及生理生化鑒定

將活化后的高耐鎘菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d后，觀察其菌落大小、顏色、組織狀態(tài)及邊緣特征，生理生化的鑒定參考標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[22]。

1.5.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

1.5.2.1 菌株 16S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

按細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明，提取出目標(biāo)菌株的基因組DNA。

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列保守性設(shè)計(jì)通用引物[23]：

上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

反應(yīng)體系 40 μL：DNA模板6 μL；上游引物 1 μL； 下游引物 1 μL；ddH2O 12 μL；2×Taq PCR Master Mix 20 μL；

PCR循環(huán)條件：96 ℃預(yù)變性4 min；96 ℃變性30 s； 55 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

1.5.2.2 序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

用經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，送到生工(上海)生物工程股份有限公司測(cè)序，在序列庫(kù)提交所測(cè)得的序列，用BLAST對(duì)比細(xì)菌的16S rDNA基因序列；將菌ZY-6測(cè)序后所得序列與GenBank中相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X進(jìn)行比對(duì)，在MEGA3.1 中采用Neighbor-Joining(鄰位發(fā)生法) 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析鑒定此菌株與模式菌株的同源性[24]。

1.6 耐鎘乳酸菌的鎘吸附特性

菌株ZY-6接種于MRS培養(yǎng)基活化18 h后，于8 000 r/min離心20 min，收集菌體，超純水洗滌2次后，將濕菌體懸浮于鎘離子質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、500、700、900 mg/L的水溶液中，使菌體終質(zhì)量濃度為5 g/L，于 37 ℃吸附2 h，8 000 r/min離心20 min，采用原子吸收分光光度計(jì)火焰法分別測(cè)定吸附前后上清液中的Cd2+濃度，代入公式(1)計(jì)算吸附率(A)。

(1)

式中：ρ0、ρ1分別為上清中Cd2+的初始和吸附后的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.7 耐鎘乳酸菌對(duì)其他重金屬的吸附性能

將活化洗滌后的ZY-6濕菌體分別懸浮于100 mg/L 的含Pb2+、Cu2+、Mn2+的水溶液中，使?jié)窬w終質(zhì)量濃度為5 g/L，于 37 ℃吸附2 h，8 000 r/min離心20 min，采用原子吸收分光光度計(jì)火焰法分別測(cè)定吸附前后上清液中的重金屬濃度，計(jì)算吸附率。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

將梯度稀釋后的四川自制泡菜汁涂布于Cd2+質(zhì)量濃度為50 mg/L的MRS固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)2～3 d后，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可知，有大量乳酸菌類似菌落長(zhǎng)出，選取128株長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落進(jìn)行劃線分離和馴化，直至得到純的單菌落。對(duì)這128個(gè)菌株進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)，篩選出革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶試驗(yàn)陰性的疑似乳酸菌7株。

圖1 初篩菌株單菌落Fig.1 Single colony of stains by primary screening

2.2 高耐鎘乳酸菌的富集、篩選及遺傳穩(wěn)定性

2.2.1 固體耐鎘結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性

挑取7株疑似乳酸菌單菌落在MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，并不斷提升培養(yǎng)基中的鎘濃度，對(duì)菌株進(jìn)行馴化，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，隨著Cd2+濃度的不斷提升，7株菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，Cd2+質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，菌株ZY-4停止生長(zhǎng)；500 mg/L時(shí)，菌株ZY-2、ZY-5、ZY-7停止生長(zhǎng)；1 300 mg/L時(shí)， 菌株ZY-1停止生長(zhǎng)；4 000 mg/L時(shí)，菌株ZY-3停止生長(zhǎng)；11 000 mg/L時(shí)，菌株ZY-6停止生長(zhǎng)。圖2顯示當(dāng)離子質(zhì)量濃度從250 mg/L上升到10 000 mg/L過(guò)程中，菌株ZY-6在平板上的菌落數(shù)在逐漸變少。將菌株ZY-6連續(xù)傳代培養(yǎng)10次后，其仍可在含10 000 mg/L的鎘培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有一定的遺傳穩(wěn)定性。

表1 七株菌株在固體高鎘培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table 1 The Growth of seven cadmium tolerant strains in solid medium containing high concentrations of Cd2+

注：“+++”表示生長(zhǎng)旺盛；“++”表示生長(zhǎng)情況一般；“+”表示菌株微生長(zhǎng)；“-”表示菌株不生長(zhǎng)。

A～I(xiàn)-Cd2+質(zhì)量濃度分別為250、400、500、1 300、2 000、4 000、6 000、9 000、10 000 mg/L圖2 ZY-6在不同Cd2+質(zhì)量濃度平板中的生長(zhǎng)情況Fig.2 The Growth of ZY-6 in solid medium containing different concentrations of Cd2+

綜上，菌株ZY-6固體耐鎘性能最好，在固體培養(yǎng)基中可以耐受10 000 mg/L的鎘，高于目前報(bào)道的菌株在高鎘平板上的耐隔性能。

2.2.2 液體耐鎘結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性

將7株菌接種于高鎘液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并不斷提升鎘濃度，測(cè)定OD600以判斷菌株的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，隨著鎘濃度的不斷提升，菌的生長(zhǎng)受到了不同程度的抑制，鎘離子質(zhì)量濃度為500 mg/L時(shí)，菌株ZY-1、ZY-2、ZY-4、ZY-5、ZY-7停止生長(zhǎng)；900 mg/L時(shí)，菌株ZY-3停止生長(zhǎng)；1 000 mg/L時(shí)，菌株ZY-6停止生長(zhǎng)。相比較其他菌株，菌株ZY-6的液體耐鎘性能最好，可以耐受900 mg/L的鎘。傳代培養(yǎng)10次后，其仍可在含900 mg/L的鎘液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)合固體耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇菌株ZY-6進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 耐鎘乳酸菌ZY-6的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)

菌株ZY-6的菌落形態(tài)如圖3。由圖3可知，菌株ZY-6在MRS固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不透明的小菌落，乳白色，表面光滑，呈微隆起圓狀輪廓，直徑1～2 mm， 較濕潤(rùn)，易挑取。

表2 七株菌株在高鎘液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Table 2 The Growth of seven cadmium tolerant strains in liquid medium containing high concentrations of Cd2+

注：表內(nèi)結(jié)果為OD600值；“-”表示不生長(zhǎng)。

圖3 ZY-6菌落形態(tài)圖Fig.3 Colonies of ZY-6

2.3.2 顯微形態(tài)

將菌株ZY-6 37 ℃培養(yǎng)2 d，形成明顯菌落后，取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如圖4所示。菌株ZY-6染色后呈現(xiàn)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈現(xiàn)不規(guī)則的短桿狀，兩端鈍圓，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢。

圖4 ZY-6顯微形態(tài)圖(×1 000)Fig.4 Morphology of single cell obeserved by microscope

2.3.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性；H2O2、乙醇氧化乙酸、淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、V-P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化、菌體運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。

2.3.4 生理試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4.1 初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

菌株接種于不同初始pH的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測(cè)定OD600，結(jié)果如圖5。ZY-6生長(zhǎng)較適的pH范圍較寬(pH=5～8)，最適pH值為7。當(dāng)pH<3或>11時(shí)，菌株ZY-6生長(zhǎng)受到抑制。

圖5 初始pH對(duì)菌株ZY-6生長(zhǎng)情況的影響Fig.5 The effect of pH on growth of ZY-6

2.3.4.2 耐鹽性實(shí)驗(yàn)

將菌株接種于不同NaCl質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測(cè)定OD600，結(jié)果如圖6所示。菌株在NaCl質(zhì)量濃度為0～30 g/L時(shí)，生長(zhǎng)得較好，最佳生長(zhǎng)NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，最大耐受NaCl質(zhì)量濃度為50 g/L， 具有一定的耐鹽性。

圖6 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌ZY-6生長(zhǎng)情況的影響Fig.6 The effect of concentration of NaCl on growth of ZY-6

2.3.4.3 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株接種于培養(yǎng)基中，置于不同溫度下培養(yǎng)后測(cè)定OD600，結(jié)果見(jiàn)圖7。可以看出菌株ZY-6在20～42 ℃ 生長(zhǎng)較好，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。

圖7 生長(zhǎng)溫度對(duì)菌株ZY-6生長(zhǎng)情況的影響Fig.7 The effect of temperature on growth of ZY-6

2.3.5 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.5.1 16S rDNA的電泳圖

以ZY-6基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增其16S rDNA， 以1%的瓊脂糖電泳，并將產(chǎn)物與Marker對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn)，菌株ZY-6在1 500 bp左右處出現(xiàn)清晰條帶，表明菌株ZY-6的16S rDNA序列大小約為1 500 bp。

圖8 16S rDNA電泳結(jié)果圖Fig.8 The electrophoresis analysis of 16S rDNA

2.3.5.2 進(jìn)化樹(shù)結(jié)果

將菌株ZY-6的PCR產(chǎn)物電泳條帶切割回收，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，序列長(zhǎng)度為1 523 bp，序列提交至Gene Bank，獲得其登錄號(hào)為MK417560，將此序列與Gene Bank中已發(fā)表的 16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建以菌株ZY-6和其相關(guān)模式菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖9所示。菌株ZY-6和WeissellaviridescensNRIC 1536 AB023236 100.0處于一個(gè)分支，同源性為100%，因此，結(jié)合形態(tài)鑒定、生理生化試驗(yàn)，確定此菌株為綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)。

圖9 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.9 Phylogenetic dendrogram

2.4 菌株ZY-6對(duì)鎘的吸附作用

檢測(cè)綠色魏斯菌ZY-6對(duì)不同Cd2+質(zhì)量濃度的吸附作用，結(jié)果見(jiàn)圖10?？梢钥闯?，菌體對(duì)于50～900 mg/L的Cd2+都呈現(xiàn)出了一定的吸附作用，隨Cd2+濃度的增大，吸附率逐漸降低，表明菌體對(duì)鎘的吸附能力有限，濃度過(guò)高會(huì)對(duì)菌體造成不良影響，從而影響菌體對(duì)鎘的吸附能力，菌體對(duì)50 mg/L的Cd2+吸附效果最好，吸附率達(dá)61.78%。

圖10 ZY-6在不同質(zhì)量濃度鎘溶液中的吸附率Fig.10 The adsorption rate of ZY-6 in solution containing different concentrations of Cd2+

2.5 菌株ZY-6對(duì)其他重金屬的吸附作用

檢測(cè)菌株ZY-6對(duì)另外3種重金屬鉛、銅、錳的吸附作用，結(jié)果見(jiàn)圖11，可以看出，菌株ZY-6對(duì)這3種重金屬都顯示出了一定的吸附效果，對(duì)鉛和銅的吸附率較高，分別為83.65%和71.31%，對(duì)錳的吸附率較低，為18.16%。菌體對(duì)于不同的金屬顯示出不同的吸附能力可能和該菌株對(duì)不同重金屬的抗性機(jī)制不同有關(guān)[25]。

圖11 菌株ZY-6對(duì)Pb2+、Cu2+、Mn2+的吸附作用Fig.11 Adsorption of Pb2+, Cu2+, Mn2+by ZY-6

3 結(jié)論

本研究從四川自制泡菜汁中篩選出高耐鎘乳酸菌株ZY-6，其在液體和固體MRS培養(yǎng)基中耐鎘質(zhì)量濃度分別為900 mg/L和10 000 mg/L，其固體耐鎘性能高于目前報(bào)道的菌株，具備較好的應(yīng)用潛力；其濕菌體對(duì)50 mg/L Cd2+的吸附率為61.34%，對(duì)100 mg/L Cd2+的吸附率為39.84%，高于邵鑫等篩選的高耐鎘乳酸菌株LAB-5的吸附率31.40%[14]。同時(shí)該菌株對(duì)多種重金屬如鉛、銅、錳顯示出一定的吸附能力，對(duì)鉛的吸附率高達(dá)83.65%。在篩選高吸附性能的菌株時(shí)將篩選標(biāo)準(zhǔn)定為當(dāng)吸附率高于18%則認(rèn)為該菌株具有高吸附性能[26]，因此，菌株ZY-6被認(rèn)為是高吸附菌株，可為復(fù)合污染的生物修復(fù)提供良好的菌株材料。

經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，該菌株屬于綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)，目前鮮見(jiàn)綠色維斯菌作為鎘吸附劑的報(bào)道，從生長(zhǎng)特性上看來(lái)，該菌株能在較寬的溫度范圍及pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)，有較好的耐鹽性，有利于其實(shí)際利用。該菌株的獲得在一定程度上豐富了耐鎘菌株資源，下一步可優(yōu)化其鎘吸附條件及研究其吸附鎘的機(jī)理。