張 靜，陳翠英，李靜靜，張七斤

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.赤峰市巴林左旗石棚溝林場(chǎng)，內(nèi)蒙古赤峰 025450；3.慶城縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅慶城 745100）

羊口瘡病毒（ORFV）B2L 基因長1 137 bp，編碼蛋白分子量大小41.67 ku。B2L 蛋白是ORFV的主要囊膜蛋白，是ORFV 粒子囊膜的重要組成部分，是主要的免疫優(yōu)勢(shì)抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有脂肪酶活性，猜測(cè)可以增強(qiáng)病毒毒力，減弱宿主免疫應(yīng)答水平[1]。B2L 蛋白與牛痘病毒的外殼抗原蛋白p37K 高度相似，主要負(fù)責(zé)胞外病毒的形成，具有較強(qiáng)的免疫原性[2]。B2L蛋白是一種棕櫚?；鞍?，作為病毒粒子囊膜表面的主要抗原，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，使淋巴細(xì)胞活化，這對(duì)于病毒的包裝和運(yùn)出來說是必不可少的[3]。盡管ORFV 免疫應(yīng)答方式以細(xì)胞免疫為主，但B2L 蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，同時(shí)刺激淋巴細(xì)胞大量增殖，且B2L 基因在副痘病毒屬中具有高度保守性[4]。

分析密碼子偏好性使用情況，用靶基因最優(yōu)密碼子設(shè)計(jì)最合適的外源表達(dá)載體，可以提高靶基因的表達(dá)量。通過優(yōu)化目的基因mRNA 中的稀有密碼子，可以避免目的基因在外源表達(dá)系統(tǒng)中出現(xiàn)表達(dá)量的降低或者翻譯速率的降低[5]。因此，本研究對(duì)克隆的B2L 基因序列，以Visual Gene Developer 軟件，分析該基因在密碼子使用上存在的偏好性，從而選擇一個(gè)最適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，以增加B2L 蛋白在表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量?；蛎艽a子的使用情況與基因所編碼的蛋白功能和二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，分析B2L 基因密碼子的使用偏好性也可以對(duì)B2L 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株

分離株ORFV/QD/2015，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室分離保存[6]。

1.2 主要試劑

病毒DNA 提取試劑盒、DL 2 000 bp DNA Marker、2×Easy Taq SuperMix、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒等，購自TIANGEN 公司。

1.3 主要儀器

G-BOXHR 紫外凝膠成像系統(tǒng)、梯度PCR 儀、BGP600i 瓊脂糖凝膠電泳儀。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 上發(fā)表的毒株OV-SA00 全基因參考序列，用Primer 5.0 生物軟件設(shè)計(jì)B2L 基因特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 特異引物序列

1.5 基因測(cè)序及生物信息學(xué)分析

將電泳檢測(cè)的條帶樣品，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，用DNAstar 軟件，將測(cè)序結(jié)果拼接。對(duì)克隆的B2L 基因序列，用Visual Gene Developer 軟件中的Codon Usage Calculation 功能，分析該基因密碼子的使用偏性，包括相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、有效密碼子數(shù)（ENC）、密碼子第3位GC含量（3GCs）。

此外，本研究所用的畢赤酵母菌（Pichia pastoris）、大腸桿菌（Escherichia coli）、昆蟲桿狀病毒（insect baculovirus）模型生物基因組的密碼子使用頻率均來源于數(shù)據(jù)庫（https://www.kazusa.or.jp/codon）。

2 結(jié)果

2.1 B2L 基因PCR 擴(kuò)增

ORFV/QD/2015 株B2L 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示，目的片段為1 137 bp。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 ORFV/QD/2015 株B2L 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 B2L 基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中密碼子使用偏性比較

利用Visual Gene Developer 軟件，分析B2L基因密碼子的使用偏性，計(jì)算B2L 基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中的相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）。結(jié)果（表2）顯示，B2L 基因在大腸桿菌中有25 種密碼子RSCU ＞1，在畢赤酵母中有33 種密碼子RSCU ＞1，在昆蟲桿狀病毒中有27 種密碼子RSCU ＞1；B2L 基因的密碼子偏好性參數(shù)分析顯示，B2L 基因在畢赤酵母、大腸桿菌、昆蟲桿狀病毒中的有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）均為20.836，密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index，CAI）分 別 為0.4836、0.6468、0.7123，3GCs 值 都 為94.723（表3）。B2L 基因密碼子在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中使用頻率第一的是CTG，在畢赤酵母和昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中使用頻率第一的均是TTG（表4）。

表2 B2L 基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子使用偏性比較

4 分析與討論

RSCU 是密碼子在編碼氨基酸的同義密碼子間的相對(duì)概率，如果RSCU 等于1，則密碼子的使用沒有偏好性；若RSCU 大于1，則該密碼子是使用較多的密碼子。有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）在20~61 之間，越靠近20 偏性越強(qiáng)。通過分析B2L 基因的密碼子偏好性參數(shù)，發(fā)現(xiàn)B2L 基因ENC 為20.836。ENC 偏小，表明各密碼子在編碼氨基酸時(shí)出現(xiàn)的頻率不一致，因此B2L基因中的各密碼子具有明顯的偏好性。

表3 B2L 基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子偏好性參數(shù)

表4 B2L 基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中密碼子使用頻率前三的密碼子

CAI 是根據(jù)已知高表達(dá)基因的序列，來估計(jì)未知基因密碼子使用的偏好性程度[7]。CAI 在0~1之間，越接近1 則表明密碼子使用偏好性越強(qiáng)[8]。B2L 基因在畢赤酵母、大腸桿菌、昆蟲桿狀病毒中的CAI 指數(shù)分別為0.4836、0.6468、0.7123，說明B2L 基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中密碼子使用偏好性較強(qiáng)。

3GCs 代表第3 位上的GC 含量。研究發(fā)現(xiàn)，偏好C/G 結(jié)尾的密碼子有利于提高翻譯的準(zhǔn)確度，表明B2L 基因編碼區(qū)在堿基選擇及其密碼子結(jié)尾堿基選擇上存在C/G 的偏好性[9-10]。3GCs 都為94.723，表明B2L 基因在3 種表達(dá)系統(tǒng)中都偏好C/G 結(jié)尾的密碼子。

5 結(jié)論

本研究運(yùn)用Visual Gene Developer 生物信息學(xué)軟件，分析ORFV B2L 基因在大腸桿菌、畢赤酵母、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子使用偏好性。綜合各表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)B2L基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中會(huì)得到更好的表達(dá)，這為B2L 基因表達(dá)系統(tǒng)的選擇提供了參考。