張 翔，劉豐波，馬 冬，宋姍姍，劉 東，劉紅祥，李 彬，王群義，欒棟祖，劉 平，邵三敏

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000）

禽戊型肝炎病毒（avian hepatitis E virus，aHEV）屬于肝炎病毒科、正戊肝病毒屬B 種，是一種無(wú)囊膜的單股正鏈RNA 病毒，病毒顆粒呈圓球狀，為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑為27~32 nm[1]。世界范圍內(nèi)分離到的aHEV 主要流行4 個(gè)基因型：澳大利亞和韓國(guó)的基因1 型、美國(guó)的基因2 型、中國(guó)和歐洲的基因3 型、匈牙利和中國(guó)臺(tái)灣的基因4 型[2]。aHEV 基因組包含3 個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），分 別 為ORF1、ORF2 和ORF3。有研究指出，使用針對(duì)ORF2 設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)與全基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)一致[3]。

2018 年山東、遼寧、吉林、陜西的4 個(gè)產(chǎn)蛋期雞群發(fā)病，臨床表現(xiàn)為：大群精神良好，采食飲水正常，但持續(xù)出現(xiàn)打蔫，每天出現(xiàn)零星死淘，日死淘率為0.1%~0.2%，病程可持續(xù)1~2 個(gè)月，累計(jì)死亡率為5.0%~15.0%。采集病雞肝臟和脾臟提取RNA，利用RT-PCR 對(duì)aHEV-ORF2 基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，以期為aHEV 的診斷和深入研究提供分子生物學(xué)依據(jù)，為我國(guó)禽戊型肝炎防控措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集自山東、遼寧、吉林、陜西4個(gè)地區(qū)雞場(chǎng)中疑似aHEV 感染的肝臟和脾臟樣品，無(wú)菌處理后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 RNAout 提取試劑盒：購(gòu)自天恩澤生物公司；HiScript?II One Step RT-PCR Kit：購(gòu)自諾唯贊生物公司；DL 2 000 bp DNA Marker：購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank 已公布的aHEV-ORF2 基因核苷酸序列，利用Oligo 6.0 引 物 設(shè) 計(jì) 軟 件，設(shè) 計(jì) 擴(kuò) 增aHEV-ORF2 基因的特異性引物。上游引物：aHEV-ORF2-F:5'-F CCCAGCCGGAAGCAGGCGCGG-3；'下游引物：aHEVORF2-R：5'-GGGTGGTGAGGGGAATGTCCTAC-3'。引物由北京華大基因科技有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增目的片段為1 700 bp。

1.2.2 核酸提取 按核酸提取試劑盒和核酸提取儀說(shuō)明書(shū)提取組織RNA。

1.2.3 核酸擴(kuò)增 用 RT-PCR 一步法試劑盒擴(kuò)增cDNA：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s；53 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存10 min。PCR 產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.4 序列分析 挑取陽(yáng)性樣品產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。用MegAlign 和Mega 6.0 軟件對(duì)測(cè)定的aHEV-ORF2基因序列與GenBank 中部分代表性毒株序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)發(fā)病雞群的品種、日齡、日死淘率以及檢測(cè)樣品的PCR 陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 病雞剖檢變化

剖檢病雞可見(jiàn)：肝臟腫大、出血、輕微黃染，有小的或斑狀的壞死點(diǎn)或壞死斑；肝臟易碎如泥，被膜下有凝血塊（圖1-A）。脾臟腫大，為正常的2~3 倍，破裂出血（圖1-B）。腹部出現(xiàn)卵黃性腹膜炎（圖1-C），卵泡萎縮、變形，有的呈“鐘擺狀”（圖1-D）。

圖1 臨床發(fā)病雞剖檢變化

2.2 RT-PCR 檢測(cè)

對(duì)送檢樣品處理后進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)送檢的4 份樣品檢測(cè)到的目的條帶大小均約1 700 bp，與目的片段大小一致（圖2）。將測(cè)序結(jié)果與GenBank 比對(duì)，結(jié)果均為aHEV 陽(yáng)性。

圖2 分離株的RT-PCR 鑒定結(jié)果

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

4 個(gè)地區(qū)的雞群均在產(chǎn)蛋期（196~480 d）發(fā)病，品種為蛋雞和肉種雞，日死淘數(shù)量為10~30只（表1）。

2.4 ORF2 核苷酸序列同源性分析

對(duì)4 個(gè)分離毒株的ORF2 核苷酸序列，利用MegAlign 進(jìn)行同源性比較。結(jié)果（圖2）顯示，分離株間的ORF2 基因同源性為84.5%~94.5%，分離株與基因1 型的澳大利亞株和韓國(guó)株同源性為81.6%~82.8%，與基因2 型的美國(guó)原型株和無(wú)毒株同源性為80.9%~82.8%，與基因3 型的歐洲株和中國(guó)株同源性為80.8%~82.5%，與基因4 型的匈牙利株和中國(guó)臺(tái)灣株同源性為81.4%~82.6%。4 株分離毒株ORF2 核苷酸與已報(bào)道的4 個(gè)基因型同源性均較低（＜84%）。

表1 4 個(gè)地區(qū)發(fā)病雞群RT-PCR 檢測(cè)情況統(tǒng)計(jì)

2.5 ORF2 基因遺傳進(jìn)化分析

利用Mega 6.0 對(duì)4 株分離株的ORF2 基因進(jìn)行序列比較，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖3）顯示：4 株aHEV 均屬于戊型肝炎B 種，形成獨(dú)立的基因分支，但不屬于已報(bào)道的4 個(gè)基因型。

3 討論

上世紀(jì)八九十年代開(kāi)始，澳大利亞、美國(guó)、加拿大等陸續(xù)報(bào)道了雞的大肝大脾病（big liver and spleen disease，BLS）或肝炎脾大綜合征（hepatitis-splenomegaly，HS）[4-5]，2001 年 分 離到病毒并將其命名為aHEV[6]。早在1994 年我國(guó)就有該病抗體陽(yáng)性的報(bào)告，2010 年從肉種雞群中分離到aHEV[7]，2014 年從海蘭褐雞群中分離到基因3 型aHEV[8]。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)南方雞群aHEV 血清陽(yáng)性率約為33.0%[9]，廣東、山東、黑龍江等地的雞群血清陽(yáng)性率約為28.3%。這些血清學(xué)調(diào)查結(jié)果均顯示，我國(guó)已有aHEV 的廣泛流行[10]。但血清學(xué)調(diào)查結(jié)果只能反映雞群的抗體水平，無(wú)法確定雞群的帶毒情況。因病毒分離難度較大，而分子生物學(xué)方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，已被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。ORF2 基因編碼蛋白是aHEV 的結(jié)構(gòu)蛋白，其擴(kuò)增序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)與全基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)一致，是目前國(guó)內(nèi)外主要的分型依據(jù)。

通過(guò)RT-PCR 方法，對(duì)山東、遼寧、吉林、陜西4 個(gè)地區(qū)發(fā)病雞群采集的肝臟和脾臟進(jìn)行檢測(cè)，均檢測(cè)到aHEV 陽(yáng)性，此疾病在蛋雞和肉種雞的產(chǎn)蛋期均易流行，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，累計(jì)死淘率較高，應(yīng)引起養(yǎng)雞企業(yè)的高度重視。

圖2 aHEV-ORF2 基因部分序列同源性分析結(jié)果

圖3 aHEV-ORF2 基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，檢出的4 株aHEV 均屬于戊型肝炎B 種，不屬于現(xiàn)已報(bào)道的4 個(gè)基因型，為新亞型。核苷酸同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，4 株aHEV與已報(bào)道的4 個(gè)基因型代表株同源性均較低（＜84%），4 株分離株之間同源性為84.55~94.5%。目前尚無(wú)關(guān)于aHEV 新亞型的相關(guān)報(bào)道，本研究為我國(guó)進(jìn)一步的aHEV 研究提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

雖有報(bào)道稱，可采用免疫亞單位疫苗防控aHEV[11]，但目前尚無(wú)商品化疫苗可用，因此養(yǎng)雞場(chǎng)只能通過(guò)加強(qiáng)生物安全防止本病傳入。

4 結(jié)論

本研究確診了山東、遼寧、吉林、陜西4 個(gè)地區(qū)引起雞群異常死淘的病因?yàn)閍HEV 感染；通過(guò)ORF2 基因序列比較，發(fā)現(xiàn)分離株均屬于戊型肝炎B 種，形成獨(dú)立的基因分支，為新亞型。本試驗(yàn)為我國(guó)的aHEV 深入研究提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。