焦秋林，王宏宇，馬梓承，劉照虎，孟凡亮，李 焱，曹龍龍，劉思當(dāng)

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

偽狂犬?。╬orcine pseudorabies，PR）是由狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性傳染病。3~4 周齡仔豬病初主要表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、下痢、厭食、精神不振，有的可見眼球上翻、視力減退、呼吸困難（呈腹式呼吸），繼而出現(xiàn)發(fā)抖、共濟(jì)失調(diào)、間歇性痙攣、后軀麻痹、作前進(jìn)或后退轉(zhuǎn)動(dòng)、倒地四肢滑動(dòng)等神經(jīng)癥狀，常伴有癲癇樣發(fā)作或昏睡，肌肉抽搐，最后衰竭而死亡，病死亡率可達(dá)40%~60%，部分耐過豬會(huì)留有后遺癥，如偏癱和發(fā)育受阻等。

副豬嗜血桿菌病是副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，主要臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟(jì)失調(diào)和被毛粗亂等。剖檢病理變化變現(xiàn)為胸膜肺炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。此外，Hps 還可引起敗血癥，并且可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行等。

PRV 與Hps 混合感染可嚴(yán)重侵害豬的機(jī)體免疫功能，更容易使豬群發(fā)生繼發(fā)性感染，導(dǎo)致較高的病死率，所以飼養(yǎng)中的正常預(yù)防與免疫顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Simply P 病毒DNA/RNA 提取試劑盒：購自杭州博日科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒：購自北京天根生化科技有限公司；DMEM/HIGH GLUCOSE：購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；T1 載體及 T1 感受態(tài)細(xì)胞：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液等：購自北京索萊寶科技有限公司；BHK 細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)室凍存；ELISA 試劑盒：購自北京金諾聯(lián)合科技有限公司。

1.2 樣品采集及處理

通過向宿主問診及對(duì)病死豬進(jìn)行剖檢觀察，初步懷疑為PRV和Hps混合感染。采集病豬的腎臟、肝臟、肺臟、脾臟、大腦、扁桃體等組織器官病料及其心包積液，其中：一份研磨后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于病原學(xué)檢查；另一份用10%福爾馬林溶液固定，用于組織病理學(xué)檢測(cè)。將心包積液、肺臟和肝臟等組織樣品，用于細(xì)菌分離與鑒定。

1.3 病毒分離

將所取病料各取0.5 g，加入1 mL PBS 混合研磨至勻漿狀態(tài)，反復(fù)凍融2 次，9 000 r/min 離心3 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 細(xì)菌過濾器過濾后備用；用DMEM 培養(yǎng)液加10%的胎牛血清，用于BHK 細(xì)胞培養(yǎng)；使用6 孔培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至單層時(shí)，加入2 mL 通過DMEM 10 倍稀釋的病毒上清液，37 ℃感作1~2 h；PBS 清洗一遍后，加入2 mL 2%的胎牛血清維持液，37 ℃培養(yǎng)并連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，收集病毒液。

1.4 病毒鑒定

用Simply P 病毒DNA/RNA 提取試劑盒，提取病毒液核酸。設(shè)計(jì)豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、PRV、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）的特異性引物（表1），運(yùn)用PCR/RT-PCR 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶位置，并判斷病原感染情況。

表1 PCR/RT-PCR 引物序列

1.5 組織病理學(xué)檢測(cè)

取出固定于10%福爾馬林溶液的組織，常規(guī)制作石蠟切片，HE 染色。

1.6 細(xì)菌分離

利用血瓊脂培養(yǎng)基，用接種環(huán)從心包積液、肺臟、肝臟中蘸取病料劃板，放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后觀察菌落生長情況。

1.7 細(xì)菌鑒定

在1.5 mL 離心管中，裝入200 μL 滅菌生理鹽水，在血瓊脂培養(yǎng)基上，用白槍頭隨機(jī)挑取6 處針尖狀、透明單一的完整菌落，與生理鹽水混合；以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后于紫外凝膠成像儀觀察目的條帶位置，判斷病豬細(xì)菌感染情況。

1.8 藥敏試驗(yàn)

將混合菌液用涂布器均勻涂布于培養(yǎng)基上，取藥敏片放于培養(yǎng)基，放于37 ℃培養(yǎng)箱，24 h 后觀察抑菌圈大小。

1.9 gE 基因序列測(cè)定

將上述目的條帶所在凝膠部分分離，使用膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，將膠回收的目的片段連接在T1 載體，轉(zhuǎn)入T1 感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)菌，鑒定為陽性菌后送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分子特征和遺傳進(jìn)化特點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床剖檢

剖檢病豬可見，心包積液并見“絨毛”狀纖維素性心包炎（圖1-A），肺表面有纖維素性滲出物，肺呈暗紅色、硬實(shí)并見灰白色壞死點(diǎn)（圖1-B），肝表面有纖維素性滲出物并見灰白色壞死點(diǎn)（圖1-C），腦膜充血（圖1-D），扁桃體充血、腫脹并見灰白色壞死點(diǎn)（圖1-E），脾表面有纖維素性滲出物并見灰白色壞死點(diǎn)（圖1-F）。

2.2 病原檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳圖（圖2）顯示，檢測(cè)樣品為PRV 陽性。

2.3 病理組織學(xué)檢測(cè)

圖1 病豬剖檢病變

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖

對(duì)病理切片鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：心外膜表面有纖維素滲出物、炎性細(xì)胞浸潤（圖3-A）；肺泡壁毛細(xì)血管嚴(yán)重充血，肺泡腔內(nèi)見少量纖維素滲出（圖3-B）；肝細(xì)胞灶狀壞死，壞死肝細(xì)胞核濃縮、深染、破碎、消失，壞死灶周圍的變性肝細(xì)胞核內(nèi)見紅染的包涵體（圖3-C）；腦組織呈病毒性腦炎病變，血管周圍淋巴細(xì)胞圍管狀浸潤，呈“袖套現(xiàn)象”，神經(jīng)元變性壞死并見噬神經(jīng)元現(xiàn)象并見紅染的核內(nèi)包涵體（圖3-D）；扁桃體隱窩黏膜上皮細(xì)胞變性壞死并見紅染的核內(nèi)包涵體，淋巴組織灶狀壞死（圖3-E），脾臟淋巴細(xì)胞灶狀壞死（圖3-F）。

圖3 鏡檢病變結(jié)果

2.4 細(xì)菌分離鑒定

瓊脂糖凝膠圖（圖4）顯示，分離的細(xì)菌為Hps 陽性。

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，根據(jù)抑菌圈直徑和MIC 解釋標(biāo)準(zhǔn)，判定該菌對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高敏，對(duì)阿莫西林、氟苯尼考、多西環(huán)素、四環(huán)素耐藥。

2.6 gE 基因遺傳進(jìn)化分析

2.6.1 病毒分離鑒定 對(duì)BHK 細(xì)胞培養(yǎng)分離得到的細(xì)胞毒，通過PCR 擴(kuò)增，確定為PRV gE 基因?yàn)殛栃?。通過對(duì)病料研磨液的PCR/RT-PCR 鑒定，發(fā)現(xiàn)CSFV、PRRSV、PCV2 均為陰性（圖2）。

圖4 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2 核苷酸和氨基酸序列分析 采用DNAstar中的MegAlign 軟件，將新分離株（XinTai SD 2019）與參考株的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸進(jìn)行同源性比較。結(jié)果（表2）顯示：新分離毒株（XinTai SD 2019）與參考株KP257591.1 JS-2012、KF130887.1 HeN 2013、KF017275.1 BJ 2013、KC415028.1 HeB 2013、GQ926932.1 HLJ 2010 的核苷酸同源性最高，為99.9%；與參考株FJ605135.1 Belgium 2010 的核苷酸同源性最低，為97.7%。新分離毒株（XinTai SD 2019）與參考株KP257591.1 JS-2012、KF130887.1 HeN 2013、KF017275.1 BJ 2013、KC415028.1 HeB 2013 的推導(dǎo)氨基酸同源性最高，為99.7%，與參考株FJ605135.1 Belgium 2010 的推導(dǎo)氨基酸同源性最低，為95.3%。

2.6.3 gE 基因遺傳演化分析 選取17 株gE 基因參考序列與分離株gE 基因序列，利用 MEGA6 的Maximum-Likelihood 方法構(gòu)建進(jìn)化樹（圖6），發(fā)現(xiàn)新分離株（XinTai SD 2019）與KC415028.1 HeB 2013、KF017275.1 BJ 2013 在同一獨(dú)立分支上，說明該分離株仍是近幾年的流行株。

3 討論

圖6 分離株與參考株gE 基因遺傳進(jìn)化樹分析

表2 新分離株gE 基因與參考株序列同源性比對(duì)結(jié)果單位：%

豬感染PRV 后的臨診特征為體溫升高，新生仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀并呈高死亡率，可侵害神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)。PR廣泛流行于世界各地，在我國也廣泛存在，是最重要的豬傳染病之一。Hps 對(duì)豬危害較大，其易感動(dòng)物只有豬。豬感染Hps 后會(huì)引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、共濟(jì)失調(diào)，造成母豬流產(chǎn)，公豬慢性跛行，豬生長發(fā)育遲緩，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展。

通過對(duì)新分離株（XinTai SD 2019）的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)新分離株與歐美參考毒株同源性較低，與我國近期分離毒株同源性較高，仍為我國近幾年流行毒株，這為疫苗的選擇使用提供了理論依據(jù)。

基于混合感染豬難以治愈，建議將癥狀較重的病豬及時(shí)隔離淘汰，癥狀較輕的病豬肌內(nèi)注射頭孢噻呋鈉（5 mg/kg），每日1 次，連用4~5 d；對(duì)豬群進(jìn)行PRV 活苗緊急免疫，同時(shí)投喂恩諾沙星和黃芪多糖。經(jīng)過上述措施后，豬群疫情逐步得到控制。

該豬場(chǎng)在防疫方面未能及時(shí)了解購進(jìn)仔豬的免疫情況，也未能及時(shí)進(jìn)行免疫和藥物預(yù)防，缺乏生物安全意識(shí)，豬場(chǎng)防疫體制不完善，是導(dǎo)致豬群發(fā)病的重要因素。

本次病例檢測(cè)分析表明，仔豬的PRV 與Hps防控壓力較大，育肥豬場(chǎng)或自繁自養(yǎng)豬場(chǎng)均應(yīng)高度重視，做到及時(shí)確診，平時(shí)做好免疫預(yù)防。