劉遠(yuǎn)，李文楊，吳賢鋒，黃勤樓，高承芳，陳鑫珠，張曉佩

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

0 引言

【研究意義】隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)肉食品的質(zhì)量有了更高的要求，畜禽肉質(zhì)性狀的遺傳改良是當(dāng)前的主要研究方向[1]。我國(guó)遺傳資源豐富，地方山羊品種或資源58個(gè)，大多數(shù)品種具有肉質(zhì)優(yōu)良的優(yōu)點(diǎn)[2]。研究地方山羊品種優(yōu)質(zhì)肉質(zhì)性狀的分子調(diào)理機(jī)理，挖掘、鑒定和充分利用控制山羊肉質(zhì)性狀的主效基因，并與傳統(tǒng)選育方法結(jié)合共同改良山羊肉質(zhì)性狀具有重要意義[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一環(huán)境或生理?xiàng)l件下所轉(zhuǎn)錄表達(dá)的所有 RNA總和，既包括編碼蛋白的mRNA，也包括非編碼RNA，是連接基因組遺傳信息與蛋白質(zhì)組生物功能的紐帶[4]。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-Seq）的發(fā)展和成熟為系統(tǒng)研究基因表達(dá)及調(diào)控提供了重要的手段和方法，在畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀分子機(jī)制研究中得到了廣泛使用[5-8]?；赗NA-Seq，研究者采用不同的策略開(kāi)展了不同羊品種肉質(zhì)性狀候選基因的篩選。孟憲然等研究了不同年齡和不同性別絨山羊背最長(zhǎng)肌之間的差異表達(dá)基因，篩選到3個(gè)可能參與肉品質(zhì)重要的候選基因[9]。張春蘭分別構(gòu)建了生長(zhǎng)性能存在顯著差異的小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)間發(fā)現(xiàn)有1 300個(gè)差異表達(dá)基因[10]。趙珺比較了絨山羊3個(gè)骨骼肌的差異表達(dá)情況，挖掘到631個(gè)新基因[11]。王位等選用以肉質(zhì)肌纖維密度差異較大的巴美肉羊與小尾寒羊的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選了 6個(gè)與肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因[3]。上述研究為轉(zhuǎn)錄組層面闡述羊肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】雖然利用RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量可能影響肉質(zhì)性狀的新候選基因，但研究的對(duì)象僅局限于我國(guó)北方的少數(shù)綿、山羊品種，而鮮見(jiàn)南方地區(qū)特色地方肉用品種的相關(guān)研究，大量品種優(yōu)良肉質(zhì)特性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)仍需開(kāi)展深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬選用肉用性能存在明顯差異的福建地方山羊品種——福清山羊（中小體型肉用品種）和福建省引進(jìn)的努比亞黑山羊（大體型肉用品種）為材料[12]，采用RNA-Seq技術(shù)比較兩者背最長(zhǎng)肌的差異表達(dá)基因及新轉(zhuǎn)錄本分析，并對(duì)篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行 GO（gene ontology）、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）功能富集和COG（cluster of orthologous groups of proteins）分類，挖掘控制福清山羊肉質(zhì)和生長(zhǎng)性狀的相關(guān)候選基因，為地方品種種質(zhì)資源的遺傳機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用的福清山羊和努比亞黑山羊由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院福清市漁溪肉羊試驗(yàn)基地提供，試驗(yàn)于2016年9月至2017年9月進(jìn)行。選擇出生日期間隔不超過(guò)3天的胎產(chǎn)雙羔羔羊作為試驗(yàn)羊，每個(gè)品種選4只，分別記錄初生重，根據(jù)福清山羊和努比亞黑山羊商品羊的生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行飼養(yǎng)管理（羯羊育肥、2月齡斷奶、周歲上市）。試驗(yàn)公羔于15日齡統(tǒng)一去勢(shì)，365日齡禁飼 12h后稱重，各品種隨機(jī)挑選3只個(gè)體（福清山羊分別標(biāo)記為F1、F2、F3，努比亞黑山羊分別標(biāo)記為 N4、N5、N6）按照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理飼喂準(zhǔn)則屠宰，取第10—12胸椎處背最長(zhǎng)肌，用于RNA提取的樣品迅速用錫箔紙包裹后于液氮中速凍，置于-80℃超低溫冰箱備用，另取20g左右樣品用于肌內(nèi)脂肪含量（inter-muscular fat,IMF）的測(cè)定。

1.2 RNA提取、轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

利用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連寶生物）提取每個(gè)樣品背最長(zhǎng)肌組織的總RNA，單個(gè)建池。為了保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，采用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度，Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。RNA樣品檢測(cè)合格后，送北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建以及測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建完成后，對(duì)建成文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。文庫(kù)質(zhì)量合格后，不同的文庫(kù)利用 Illumina HiSeq2500平臺(tái)（Illumina，America），基于邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis，SBS）技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

原始測(cè)序數(shù)據(jù)（Raw reads）經(jīng)過(guò)去除含有接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾后獲得高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)（clean reads）。利用TopHat2[13]軟件將獲得的Clean reads比對(duì)到山羊參考基因組（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/001/704/415/GCF_001704415.1_ASM170441v1/GCF_001704415.1_ASM170441v1_genomic.fna.gz）[14]，獲取序列在參考基因組或基因上的位置信息，以及樣品特有的序列特征信息。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選、功能注釋和富集分析

參考JIANG等報(bào)道的數(shù)學(xué)模型[15]，使用Cufflinks軟件的Cuffquant和Cuffnorm組件，通過(guò)比對(duì)到的序列（Mapped Reads)在基因上的位置信息，對(duì)轉(zhuǎn)錄本和基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量。采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)[16]，即每百萬(wàn)個(gè)比對(duì)到的 reads中比對(duì)到外顯子的每千堿基上的片段數(shù)目。

以努比亞黑山羊?yàn)閷?duì)照，利用DEseq進(jìn)行2個(gè)品種間的差異表達(dá)分析[17]。在差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）檢測(cè)過(guò)程中，將差異倍數(shù)（Fold Change）≥2 且 FDR（False Discovery Rate，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）＜0.01作為DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)。繪制2個(gè)品種DEGs火山圖（volcano plot）并進(jìn)行聚類分析。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行功能注釋[18]。COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行DEGs分類統(tǒng)計(jì)[19]。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行DEGs的通路分析[20]。

1.5 熒光定量PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果以及發(fā)現(xiàn)新基因（轉(zhuǎn)錄本）序列的準(zhǔn)確性，以18S rRNA為內(nèi)參基因，根據(jù)差異表達(dá)基因結(jié)果，隨機(jī)挑選 6個(gè)差異表達(dá)的基因（包括3個(gè)新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本），2個(gè)非差異表達(dá)基因Ⅰ型肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chainⅠ，MyHCⅠ）和Ⅱb型肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chainⅡb ,MyHCⅡb）基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證基因表達(dá)量。內(nèi)參基因、MyHCⅠ、MyHCⅡb基因引物參考文獻(xiàn)[21]設(shè)計(jì)，其余差異表達(dá)基因引物根據(jù)測(cè)序序列信息由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)，鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，基因名稱及引物信息見(jiàn)表1。以1.2中各樣品RNA池為模板，采用TAKARA PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連寶生物）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系 20μL：cDNA 模板 1μL，上、下游引物各 1μL，2×SYBR? Select Master Mix 10μL，ddH2O 7μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 2 min；95℃變性10s，60℃退火 10s，72℃延伸 40s，50個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min；4℃保存。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

EXCEL用于數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計(jì)以及作圖，品種間表型差異采用 SPSS17.0的“Independent-Sample T Test”程序計(jì)算分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息Table1 The qRT-PCR primers

2 結(jié)果

2.1 樣品的IMF、生長(zhǎng)性狀測(cè)定

IMF是影響羊肉品質(zhì)的重要因素之一，其對(duì)羊肉大理石紋、嫩度、風(fēng)味及膻味等均有重要影響。一般認(rèn)為IMF含量超過(guò)3%的肌肉品質(zhì)較好，福清山羊背最長(zhǎng)肌的平均IMF含量為3.69%，顯著高于努比亞黑山羊背最長(zhǎng)肌的1.83%（P=0.003），表明本研究選用的2個(gè)品種樣品間肉質(zhì)表型存在明顯差異（表2）。而努比亞黑山羊個(gè)體的初生重、宰前活重和平均日增重均顯著高于福清山羊個(gè)體（P=0.000），品種間生長(zhǎng)性狀的差異較大（表2）。

表2 各樣品IMF和生長(zhǎng)性狀分析Table2 The IMF and growth traits of 6 samples

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估及對(duì)比分析

經(jīng)過(guò)文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和測(cè)序質(zhì)量控制，各樣品均符合測(cè)序要求。6個(gè)樣品共得到44.76Gb Clean Data，各樣品Clean Data 均達(dá)到6.77Gb以上，獲得Clean reads 22737051—26944107條。測(cè)序數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量質(zhì)Q30堿基百分比為 91.01%—92.01%，堿基 GC含量為52.36%—53.87%，各堿基質(zhì)量穩(wěn)定在 20%—30%之間，低質(zhì)量堿基比例小，測(cè)序質(zhì)量好。表明文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量和測(cè)序質(zhì)量高，測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，滿足后續(xù)分析條件。

將獲得的Clean reads與參考山羊基因組進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明各樣品的Clean reads與參考基因組的比對(duì)效率在84.65%—86.17%之間，比對(duì)到參考基因組唯一位置的Reads占Clean Reads的百分比為79.50%—81.44%，多處位置的百分比為4.04%—5.53%（表3）。

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)與參考山羊基因組的序列比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table3 RNA-Seq and mapping to the reference genome

2.3 DEGs的篩選、功能注釋和富集分析

2.3.1 DEGs的篩選 采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，計(jì)算得到了6個(gè)樣本17 302個(gè)表達(dá)基因的FPKM值。根據(jù)差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得了努比亞黑山羊和福清山羊背最長(zhǎng)肌的DEGs608個(gè)，其中上調(diào)基因61個(gè)，下調(diào)基因547個(gè)，圖1為差異表達(dá)基因火山圖。進(jìn)一步的選擇與畜禽能量脂肪代謝、肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)DEGs中類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor 1，IGF1)、長(zhǎng)鏈酯酰輔酶 A合成酶 5（Long-chain fatty acyl-CoA synthetases 5，ACSL5）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 2（phosphoenolpyruvate carboxykinase 2，PCK2）、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體 γ共激活因子 1α（Hepatic peroxisome proliferator-activated receptor gamma，coactivator 1 alpha，PPARGC1A）、Janus激酶2基因（Janus Kinase 2，JAK2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）、干擾素調(diào)節(jié)因子8（interferon regulatory factor 8，IRF8）、有絲分裂原激活蛋白激激激激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 1，MAP4K1）可作為控制福清山羊肉質(zhì)性狀和生長(zhǎng)性能的候選基因。

進(jìn)一步對(duì)篩選出的DEGs做層次聚類分析，將具有相同或相似表達(dá)模式的基因進(jìn)行聚類，DEGs聚類結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2的橫坐標(biāo)表明2個(gè)品種的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別聚類在一起，說(shuō)明同一品種的生物學(xué)重復(fù)樣品間有很高的相關(guān)性；縱向DEGs分為明顯的上調(diào)和下調(diào)兩個(gè)基因簇，上調(diào)和下調(diào)基因簇內(nèi)分別具有較高的相關(guān)性。說(shuō)明本研究選用的樣本生物學(xué)重復(fù)性好，樣本分組合理。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes

2.3.2 差異表達(dá)基因的GO功能富集 GO注釋系統(tǒng)是一個(gè)有向無(wú)環(huán)圖，包含3個(gè)主要分支，即：生物學(xué)過(guò)程（biological process, BP），細(xì)胞組分（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）。篩選出的608個(gè)DEGs中的518個(gè)基因能夠被GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，GO分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3。被注釋的DEGs分別參與了BP、CC和MF的22、19和20個(gè)功能亞分類。在 BP分類中，細(xì)胞過(guò)程、單一的生物過(guò)程和生物調(diào)節(jié)參與的DEGs最多，與肉質(zhì)和生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)的發(fā)育過(guò)程和生長(zhǎng)的DEGs也被注釋。在CC分類中，DEGs參與細(xì)胞部分、細(xì)胞、細(xì)胞器的數(shù)量最多。在MF分類中，DEGs在結(jié)合中所占比例最高，其次為催化活性及分子傳感器活性。

圖2 差異表達(dá)基因聚類分析熱圖Fig.2 Heat map of the differentially expressed genes

2.3.3 差異表達(dá)基因的COG分類 利用COG數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。篩選的 148個(gè)DEGs能夠被COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。其中一般的功能預(yù)測(cè)基因數(shù)目最多，其次為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、重組與修復(fù)。

2.3.4 差異表達(dá)基因的 KEGG注釋 經(jīng)過(guò)分析，可被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的418個(gè)差異表達(dá)基因參與了近100個(gè)通路，將差異表達(dá)基因KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類，分類圖見(jiàn)圖5。差異表達(dá)基因參與最多的是人類疾病相關(guān)的通路，其次是生物系統(tǒng)相關(guān)通路?？赡芘c肉質(zhì)性狀和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的通路有肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、Jak-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Ⅰ型糖尿病通路等。

以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)總通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在DEGs中顯著性富集的通路。圖6為DEGs的KEGG通路富集分析結(jié)果，圖中呈現(xiàn)了顯著性Q值最小的20個(gè)通路，富集顯著性最可靠的通路大部分為人類疾病相關(guān)的通路。

2.4 新基因分析

基于所選參考基因組序列，使用Cufflinks軟件對(duì)Mapped Reads進(jìn)行拼接，并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較，尋找原來(lái)未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)，發(fā)掘該物種的新轉(zhuǎn)錄本和新基因，從而補(bǔ)充和完善原有的基因組注釋信息。過(guò)濾掉編碼的肽鏈過(guò)短（少于50個(gè)氨基酸殘基）或只包含單個(gè)外顯子的序列，共發(fā)掘707個(gè)新基因（轉(zhuǎn)錄本），其中15個(gè)為2個(gè)品種的差異表達(dá)基因。

圖3 差異表達(dá)基因GO注釋Fig.3 GO annotation of DEGs

圖4 差異表達(dá)基因COG注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 COG annotation classification statistics of DEGs

圖5 差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路Fig.5 List of KEGG pathway for DEGs

圖6 差異表達(dá)基因KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig.6 Enriched scatter map of DEGs KEGG pathway

2.5 Real-time PCR驗(yàn)證測(cè)序

8個(gè)基因（轉(zhuǎn)錄本）的 qRT-PCR結(jié)果見(jiàn)表4，選擇的目的基因在2個(gè)品種個(gè)體間表達(dá)變化模式與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得差異表達(dá)基因以及新基因（轉(zhuǎn)錄本）序列數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確。

表4 測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證Table4 Validation of sequencing results by qRT-PCR

3 討論

陳其新等應(yīng)用綜合指數(shù)法結(jié)合聚類分析法，對(duì)我國(guó)22個(gè)山羊品種的肉用生產(chǎn)力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其中努比亞黑山羊生產(chǎn)指數(shù)的擬合度高，體型大、生長(zhǎng)速度快、生產(chǎn)效率高，肉用性能優(yōu)于波爾山羊，是適宜的雜交父本；而福清山羊的生產(chǎn)指數(shù)擬合度低，體型小、生長(zhǎng)速度慢、生產(chǎn)效率低，屬于肉用性能較差的品種[12]。本研究證實(shí)了在相同飼養(yǎng)條件下2個(gè)品種肉用性能存在明顯差異，努比亞黑山羊的 ADG極顯著高于福清山羊（P=0.000）。

目前有關(guān)福清山羊肉質(zhì)特性的評(píng)價(jià)僅限于人們的主觀印象，缺乏客觀的科學(xué)數(shù)據(jù)。肌纖維類型和IMF含量是影響羊肉質(zhì)特性的2個(gè)主要因素[22]。MyHCⅠ型和MyHC2b型肌纖維的含量差異會(huì)造成肉質(zhì)差異，富含MyHCⅠ型肌纖維的肉品質(zhì)優(yōu)[21]，2個(gè)品種背最長(zhǎng)肌的高通量測(cè)序和 qRT-PCR結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)MyHCⅠ基因和MyHC2b基因的差異表達(dá)，初步表明肌纖維類型不是引起2品種肉質(zhì)差異的主要原因，而背最長(zhǎng)肌 IMF含量的極顯著差異（P=0.003）可能是品種間肉質(zhì)差異的關(guān)鍵。

畜禽肉質(zhì)、生長(zhǎng)性狀的表型主要取決于相互聯(lián)系的肌纖維發(fā)育和IMF沉積的2個(gè)肌肉生長(zhǎng)過(guò)程[23]。本研究利用RNA-Seq篩選的DEGs中，IGF1是肌糖原代謝的功能基因[24]，PCK2、MAP4K1、JAK2、STAT4屬于參與成肌細(xì)胞增殖、分化和肌纖維類型轉(zhuǎn)化的功能基因[23]，這5個(gè)重要功能基因的差異表達(dá)可能影響 2個(gè)品種的生長(zhǎng)性狀；ACSL5、PPARGC1A參與了脂肪細(xì)胞增殖、分化和脂類代謝調(diào)控[23]，可能影響2個(gè)品種骨骼肌的IMF沉積，影響肌肉的肉質(zhì)特性。

試驗(yàn)材料的類型（體現(xiàn)表型的組織或者組成表型的細(xì)胞）、品種或個(gè)體本身的差異以及DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)等均會(huì)影響 RNA-Seq差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果[25]。本研究獲得的DEGs類型、數(shù)量與王位等[3]、孟憲然等[9]研究其他肉羊品種骨骼肌研究結(jié)果存在一定的差異，且本研究中DEGs參與最多的是人類疾病相關(guān)的通路。除了材料不同造成的結(jié)果差異外，可能福清山羊和努比亞黑山羊在抗病、免疫性狀方面也存在較大表型差異，有待進(jìn)一步深入研究。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，動(dòng)物遺傳學(xué)從以前候選基因、單一性狀為主的微觀研究轉(zhuǎn)向以物種進(jìn)化構(gòu)架內(nèi)的全基因組水平、多性狀、組學(xué)化的宏觀研究，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究畜禽主要經(jīng)濟(jì)性狀取得了較大的研究進(jìn)展[26]?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Jak-STAT信號(hào)通路等與畜禽肉質(zhì)、生長(zhǎng)性狀相關(guān)的代謝通路也在不同物（品）種被相繼發(fā)現(xiàn)。馮小婷等[27-28]分別利用高通量芯片研究瘦肉型和脂肪型豬品種背最長(zhǎng)肌的差異基因表達(dá)譜，均發(fā)現(xiàn)DEGs富集到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路；王穎萍[29]利用RNA-Seq技術(shù)研究豬脂肪沉積相關(guān)的 miRNA，結(jié)果表明差異表達(dá)的miRNA的靶基因參與了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)。XUE等[30]對(duì)不同生長(zhǎng)階段京海黃雞腿肌進(jìn)行RNA-Seq，發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。LIU等[31]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了北京油雞肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制，認(rèn)為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路在肌內(nèi)脂肪沉積中起到最重要的作用。利用RNA-Seq技術(shù)分別篩選小尾寒羊與巴美肉羊背最長(zhǎng)肌組織[3]、小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌組織[32]的DEGs的KEGG顯著性富集分析均發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路，但不同年齡和不同性別絨山羊背最長(zhǎng)肌[9]之間的 DEGs未富集到該通路。

MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要分為4類，第一類是胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs），第二類是c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinases, JNKs）,第三類為p38，第四類為ERK5通路，不同的通路分別應(yīng)答不同的胞外信號(hào)，產(chǎn)生不同的效應(yīng)[33]。研究證實(shí)ERK1/2通路、JNK通路和p38通路對(duì)肌發(fā)生的過(guò)程都有調(diào)控作用，其中p38正調(diào)控肌細(xì)胞分化[34]，JNKs[35-36]和ERKs[37]抑制肌細(xì)胞分化、促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖。馮小婷[27]、王穎萍[29]研究表明MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了豬脂肪沉積過(guò)程；HOU等[38]研究miR-378在肌肉發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-378后出現(xiàn)下調(diào)的基因涉及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；LUO等[39]研究表明MAPK通路活性在性連鎖矮小雞和正常雞骨骼肌中存在顯著差異是導(dǎo)致前者肌肉發(fā)育異常的潛在因素。孟憲然等[9]研究不同年齡和不同性別絨山羊背最長(zhǎng)肌之間的DEGs，DEGs富集到MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但相應(yīng)的其他羊品種研究中未發(fā)現(xiàn)該通路[3,32]。

Jak-STAT信號(hào)通路是一條涉及多種細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。JAKs通過(guò)和受體聚集后的磷酸化而產(chǎn)生活性，再催化STATs上相應(yīng)部位的酪氨酸殘基使其磷酸化，后者再與STATs對(duì)應(yīng)功能區(qū)相互作用活化STATs，具有活性的STATs進(jìn)入細(xì)胞核與其他轉(zhuǎn)錄因子一起參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[40]。研究表明該通路參與了豬肌肉發(fā)育過(guò)程，影響豬肉質(zhì)性狀的形成[27，38]。然而基于RNA-Seq技術(shù)篩選的不同羊品種肌肉間的 DEGs尚未發(fā)現(xiàn)富集到該通路，也未發(fā)現(xiàn)本研究富集到的與能量代謝有關(guān)的Ⅰ型糖尿病通路[3，9，32]，這2個(gè)通路對(duì)羊肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育的影響需要深入的研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)體型差異大的福清山羊和努比亞黑山羊的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行RNA-Seq分析，在轉(zhuǎn)錄組水平上篩選出了與羊肉質(zhì)和生產(chǎn)性能相關(guān)的 608個(gè)DGEs，包括 15個(gè)首次發(fā)現(xiàn)的新轉(zhuǎn)錄本（基因）。并且初步明確了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、Jak-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Ⅰ型糖尿病通路等 4個(gè)可能與肉質(zhì)性狀和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的通路。該研究為揭示福清山羊“生長(zhǎng)速度慢”、“肉質(zhì)優(yōu)良”等種質(zhì)資源特性形成的分子機(jī)制提供了線索，為開(kāi)發(fā)和利用畜禽優(yōu)良性狀分子標(biāo)記提供了參考依據(jù)。