羅怡爽 林韓特 代曼云 胡瀟威 劉愛(ài)明

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究室 (浙江 寧波， 315211)

膽汁淤積是由于膽汁形成和分布障礙而在肝細(xì)胞、膽管中蓄積。臨床主要包括原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)以及各型病毒性肝炎所致的膽汁淤積；若得不到有效治療，各種膽汁淤積性肝病均有可能進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化、肝腫瘤[1]。目前，膽汁淤積性肝病尚無(wú)有效的治療藥物，即使是有30多年應(yīng)用歷史的熊去氧膽酸(UDCA)也有50%患者不產(chǎn)生藥效學(xué)反應(yīng)，且腹瀉、皮膚瘙癢等不良反應(yīng)也被報(bào)道[2]。而2016年通過(guò)FDA批準(zhǔn)的奧貝膽酸(OCA)目前仍處于Ⅳ期臨床試驗(yàn)階段，臨床效果還有待時(shí)間檢驗(yàn)，因此尋求有效治療PBC和PSC等膽汁淤積性肝病的新策略具有積極意義。在近期實(shí)驗(yàn)中我們明確了非諾貝特激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體a (PPARa)，進(jìn)一步抑制JNK炎癥通路預(yù)防α-荼基異硫氰酸鹽(ANIT)誘導(dǎo)PBC[3]，但非諾貝特對(duì)PSC的治療作用尚不清楚。本研究通過(guò)3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶(DDC)誘導(dǎo)PSC小鼠模型，探討非諾貝特對(duì)小鼠PSC的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只6～8周齡SPF級(jí)129/Sv雄性小鼠，體質(zhì)量(23.0±2.0)g，購(gòu)自南京模式動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物研究方案及操作流程由寧波大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 試劑：非諾貝特(湖南千金湘江藥業(yè))；玉米油(上海阿拉丁)；DDC(Sigma公司)；Trizol(Ambion Invitrogen公司)，RT試劑和qPCR試劑(北京康為世紀(jì)生物科技公司)；定量PCR試劑(SYBR Green PCR Master Mix，Roche公司)；血清生物化學(xué)檢測(cè)試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司)。儀器：石蠟包埋機(jī)(BM-Ⅶ，湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器)，切片機(jī)(HM-325，德國(guó)LEICA公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，定量PCR儀(LightCycle 480，Roche公司)。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Nomal control組)、模型組(Model組)，治療組(Model+feno組)和非諾貝特組(Feno組)，每組5只。參考相關(guān)報(bào)道，除正常對(duì)照組和非諾貝特組外，其余各組動(dòng)物均給予0.1% DDC飼料喂養(yǎng)[4,5]。根據(jù)我國(guó)與歐洲肝病學(xué)專家共識(shí)，血清酶學(xué)的升高作為對(duì)診斷PSC有重大意義[6]，通過(guò)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血清酶學(xué)變化，確定DDC干預(yù)5 d后成功誘導(dǎo)PSC模型。第6天起，給予治療組及非諾貝特組小鼠25 mg/kg非諾貝特(玉米油超聲溶解)灌胃，2次/d，持續(xù)8 d。

1.4 血樣采集及生化分析 在非諾貝特灌胃的第1、3、6、9天，尾靜脈采血檢測(cè)小鼠血清ALT、AST水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)眼球取血，4℃、3 600 r/min離心15 min分離血清，檢測(cè)ALP、TBA等生化指標(biāo)。

1.5 肝臟病理學(xué)檢測(cè) 小鼠肝臟放于10% 中性福爾馬林緩沖溶液固定24 h后，脫水，石蠟包埋。常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6 肝臟膽汁酸排泄基因和炎癥基因mRNA表達(dá)檢測(cè) qPCR實(shí)驗(yàn)方法及步驟參考本課題組已發(fā)表文章[3]。引物序列信息來(lái)自公共數(shù)據(jù)(http://mouseprimerdepot.nci.nih.gov/)，見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠血清膽汁淤積指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖1。 在DDC誘導(dǎo)PSC模型后，給予非諾貝特治療8 d，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清ALP、TBA水平明顯升高(P<0.01)，膽囊系數(shù)增大(P<0.01)；與模型組相比，治療組小鼠血清ALP、TBA均明顯降低(P<0.01)，膽囊系數(shù)下降至正常(P<0.01)，肝系數(shù)有所上升(P<0.05)。

與正常對(duì)照組比較，** P< 0.01；與模型組比較，## P< 0.01

2.2 4組小鼠不同時(shí)段肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2。 給予非諾貝特治療3～6 d后小鼠ALT、AST水平開(kāi)始呈下降趨勢(shì)(P<0.05或P<0.01)，在第6～9天治療組小鼠肝功能恢復(fù)接近正常對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

與正常對(duì)照組比較，** P< 0.01；與模型組比較，## P< 0.01

2.3 4組小鼠肝組織病理情況 鏡下觀察，正常對(duì)照組小鼠肝臟外觀正常；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核大而圓，核膜清晰，胞漿豐富、淡染。模型組小鼠肝臟外觀呈現(xiàn)暗紅色，膽囊腫大，膽汁呈深褐色；細(xì)胞著色有加深，提示有可能發(fā)生凋亡；肝小葉輪廓不清，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織輕度壞死，膽汁淤積嚴(yán)重，膽管增生。治療組小鼠肝組織上述病理變化均明顯減輕。非諾貝特組小鼠肝臟病理無(wú)明顯病理學(xué)改變。見(jiàn)插頁(yè)圖3。

2.4 4組小鼠肝臟膽汁酸代謝基因 見(jiàn)圖4。 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟膽汁酸合成酶Cyp8b1和Cyp7a1與攝取基因Oatp2和Oatp1表達(dá)分別下降86%、44%和52%、99%(P<0.05或P<0.01)，膽汁酸排泄基因Ostb和Mdr1a表達(dá)升高47倍和5倍(P<0.01)；與模型組相比，治療組小鼠Cyp8b1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)504%(P<0.05)，并下調(diào)排泄基因Ostb和Mdr1a轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平82%和48%(P<0.01)。非諾貝特組小鼠上述基因轉(zhuǎn)錄水平與正常對(duì)照組相當(dāng)。

與正常對(duì)照組比較，* P< 0.05, ** P< 0.01；與模型組比較，# P< 0.05, ## P< 0.01

2.5 4組小鼠肝臟炎癥因子和基因檢測(cè)情況 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠炎癥基因Il1β、Il6、c-Jun和c-Fos表達(dá)升高4～8倍(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，治療組小鼠Il1β、Il6、c-Jun和c-Fos mRNAs分別下降42%、65%、66%和73%(P<0.05或P<0.01)，甚至逆轉(zhuǎn)至正常組水平。見(jiàn)圖5。

與正常對(duì)照組比較，* P< 0.05, ** P< 0.01；與模型組比較，# P< 0.05, ## P< 0.01

3 討論

膽汁淤積性肝病發(fā)病率高。PSC是膽汁淤積性肝病的主要病癥之一，表現(xiàn)為肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥，病情進(jìn)行性發(fā)展，最終將進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭，患者生存將依賴于肝臟移植[7]。DDC開(kāi)發(fā)為PSC模型的工具藥，多項(xiàng)研究肯定DDC誘導(dǎo)PSC模型的可行性，以血清酶學(xué)指標(biāo)和組織病理學(xué)分析PSC模型的建立，這與本研究分析基本一致[8]。

多項(xiàng)研究證實(shí)PPARa是一個(gè)多功能的核受體，它可以直接或者間接介導(dǎo)破壞膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的平衡，如野生型和基因敲除小鼠食飼吉非羅齊飼料的不同表現(xiàn)，也可以正面維持體內(nèi)膽汁酸穩(wěn)態(tài)，如硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的研究[9]；膽汁淤積性肝病中，PPARa可以介導(dǎo)致炎和抗炎，如全氟癸酸基于PPARa誘導(dǎo)了膽汁酸穩(wěn)態(tài)破壞激發(fā)炎癥，同時(shí)基于抗炎發(fā)揮了對(duì)抗作用[10]。

非諾貝特是核受體PPARα激動(dòng)劑，在我們之前的研究中，非諾貝特可明顯預(yù)防PBC，本研究探討了相同的給藥方案治療DDC誘導(dǎo)PSC的作用與機(jī)制。給予非諾貝特治療后，DDC誘導(dǎo)的PSC小鼠膽汁酸合成酶Cyp8b1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)接近正常，排泄基因Ostb和Mdr1a表達(dá)下調(diào)；并下調(diào)了炎癥基因Il-1β、Il-6、c-Fos和c-Jun的表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明藥物治療PSC與抑制炎癥有關(guān)，而膽汁酸代謝排泄的改變屬于代償性改變。

臨床實(shí)踐中，非諾貝特用于治療高脂血癥的劑量為150～300 mg/d，而貝特類藥物用于治療膽汁淤積性肝病的臨床研究多采用此劑量[11,12]。文獻(xiàn)報(bào)告在大鼠、小鼠等模型中研究非諾貝特防治膽汁淤積性肝病時(shí)，藥物劑量多為50～200 mg/kg[13,14]。在本研究中，我們采用的25 mg/kg、2次/d的給藥方案，結(jié)果表明該劑量仍然可以完全抑制DDC誘導(dǎo)的PSC，提示低劑量非諾貝特可能對(duì)各種膽汁淤積性肝病都具有良好的治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)DDC誘導(dǎo)的PSC小鼠模型評(píng)估了非諾貝特對(duì)PSC的治療作用，并從藥物干預(yù)下的膽汁酸代謝代償性改變和PPARa介導(dǎo)的抑制炎癥等方面進(jìn)行了分析，提示低劑量非諾貝特能有效治療膽汁淤積性肝病，值得進(jìn)一步研究。