李佳婷,高靜陽,孫春雨,萬小榮,吳平治,陳雅平,李美茹,姜華武,吳國江*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,a.園藝園林學(xué)院,b.農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,廣州 510225；2.中國科學(xué)院華南植物園,中國科學(xué)院植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510650；3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

根據(jù)國家海關(guān)總署數(shù)據(jù)，2017年我國食用油籽進(jìn)口量達(dá)1.02×108t，已超過我國食用油籽消費(fèi)量的70%，早已超過了國際糧油安全預(yù)警線，而我國食用油消費(fèi)量最大的大豆油，2017年進(jìn)口了9.554×107t大豆原料，對外依存度高達(dá)87%。因此尋找新型食用油油料植物資源已成為克服我國糧食安全的重要途徑之一。油莎豆(Cyperus esculentus)可作為主糧的有效補(bǔ)充和新的食物來源[1]，干產(chǎn)量可達(dá)7.5 t hm-2以上[2]。2007年油莎豆油被我國認(rèn)證為無公害農(nóng)產(chǎn)品,2012年又被認(rèn)證為有機(jī)產(chǎn)品。此后農(nóng)業(yè)部分別于2015年11月和2016年6月發(fā)文建議適宜地區(qū)示范推廣種植油莎豆,以調(diào)整種植結(jié)構(gòu)和增加新的食用油來源[3]。

油莎豆又名油莎草、鐵荸薺、洋地栗，是莎草科(Cyperaceae)莎草屬的多年生草本植物，常作一年生作物栽培，以塊莖繁殖，是目前已知的能夠在塊莖貯藏大量油脂的唯一作物[4]。原產(chǎn)于非洲地中海地區(qū)，1952年首次由北京植物園從蘇聯(lián)引進(jìn)，1960年又再次從保加利亞引進(jìn)[5]。油莎豆適應(yīng)性極強(qiáng),全生育期為70～150 d，3月初至7月均可播種[2]。油莎豆喜溫暖濕潤氣候，耐旱、耐澇、耐貧瘠且耐鹽堿，最適宜沙壤土。

我國油莎豆的遺傳多樣性很低，現(xiàn)有優(yōu)良品種很少。加之油莎豆在我國氣候條件下一般不開花或者開花不結(jié)實(shí)，因此利用常規(guī)雜交方法培育新的優(yōu)良品種比較困難[3]。而長期用塊莖繁殖，易出現(xiàn)品種退化、遺傳不穩(wěn)定、品質(zhì)下降、帶菌嚴(yán)重等問題。組織培養(yǎng)是加速植物繁殖的一種簡單、快捷的有效方法，可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的種質(zhì)創(chuàng)新、種苗的規(guī)?；a(chǎn)[6]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到越來越廣泛的應(yīng)用。目前，國內(nèi)外對油莎豆的組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)研究較少，大大限制了油莎豆的遺傳育種和種質(zhì)創(chuàng)新。因此，本文以油莎豆莖尖為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同濃度的6-BA、KT、NAA進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)，從而建立油莎豆快速繁殖的離體培養(yǎng)體系，為高效繁育油莎豆優(yōu)質(zhì)種苗和種質(zhì)資源優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為中國科學(xué)院華南植物園能源植物組從云南省保山市收集并保存的小粒型油莎豆(Cyperus esculentus)塊莖。

1.2 塊莖處理

選取飽滿、無蟲眼、帶完整芽眼的塊莖，將表面的須根與鱗片除凈，用自來水沖洗后浸泡3 d,期間經(jīng)常換水。先用75%乙醇浸泡1 min，用無菌水清洗5～6次，再用7.5%(W/V)次氯酸鈉浸泡50 min后用無菌水清洗1～2次。為徹底去除雜菌，用加有0.05%(V/V)Tween-20和500 mg L-1頭孢的無菌水清洗2～3次，最后用無菌水清洗2～3次。置于無菌紙上吸干塊莖表面水分，移至頂芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.2 mg L-1NAA+0.5 mg L-16-BA+500 mg L-1頭孢+30 g L-1蔗糖+8.0 g L-1瓊脂，pH 5.8[7]。

1.3 叢生芽增殖培養(yǎng)

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，按表1添加生長調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)pH至5.8。生長調(diào)節(jié)劑按L9(3)4正交試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，生長調(diào)節(jié)劑有3種：6-BA、KT、NAA,每種設(shè)置3個(gè)濃度水平，6-BA：0.5、1.0、2.0 mg L-1；KT：0、0.2、0.5 mg L-1；NAA：0、0.02、0.2 mg L-1。每瓶接種6個(gè)外植體，每處理接種7瓶，重復(fù)3次。每周觀察試管苗生長情況，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)肉眼可見的叢生芽個(gè)數(shù)，增殖系數(shù)=(叢生芽總數(shù)-外植體總數(shù))/外植體總數(shù)。

1.4 生根培養(yǎng)

以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，以不添加生長調(diào)節(jié)劑、添加0.1 mg L-1IBA或者NAA為處理，pH為5.8。每瓶接種6個(gè)外植體，每處理接種7瓶，重復(fù)3次。觀察試管苗的生根時(shí)間和根生長狀況，10 d后統(tǒng)計(jì)平均生根率和平均生根數(shù)，平均生根率=生根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)；平均生根數(shù)=生根總數(shù)/外植體總數(shù)。

培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，每天光照14 h，黑暗10 h,相對濕度為(55±5)%，光強(qiáng)為150μmol m-2s-1，所有培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和0.8%瓊脂。

2 結(jié)果和分析

2.1 組織培養(yǎng)過程

消毒后的塊莖置于頂芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基約1周，塊莖開始萌發(fā)(圖 1：A)。切割莖尖為單芽(圖 1：B)，用70%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞浸泡10 min，用加有0.05%(V/V)Tween-20的無菌水清洗3次，再用無菌水沖洗5次，置于無菌紙上吸干表面水分，接種至MS+0.05 mg L-1NAA+0.5 mg L-16-BA培養(yǎng)基上(圖 1：C)，pH 5.8，10 d 左右可誘導(dǎo)出新芽(圖 1：D)，2個(gè)月后得到大量叢生芽(圖1：E)。選取長勢一致的無菌苗為外植體進(jìn)行生根誘導(dǎo)。

圖1 油莎豆的組織培養(yǎng)Fig.1 Tissue culture of Cyperus esculentus

2.2 生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽增殖的影響

從表1可見，3個(gè)生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽增殖的影響為6-BA＞NAA＞KT。方差分析(表2)表明，6-BA對叢生芽增殖的影響顯著，NAA和KT的影響不顯著。由圖2可以看出，6-BA對叢生芽增殖起促進(jìn)作用，而NAA則起抑制作用。綜合極差分析和方差分析，若僅考慮生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽增殖的影響，生長調(diào)節(jié)劑的最佳組合為A3B2C1，即2.0 mg L-16-BA+0.5 mg L-1KT，增值系數(shù)為9.49。但叢生芽的增殖系數(shù)不能成為油莎豆快繁的唯一指標(biāo)，經(jīng)觀察6-BA雖對油莎豆叢生芽增殖有促進(jìn)作用，但對葉狀莖的生長隨濃度增大有顯著的不利作用，較高濃度的6-BA誘導(dǎo)出的新芽出現(xiàn)葉片卷曲、新生芽弱小的現(xiàn)象(圖3：S8,S9),因此油莎豆試管苗增殖過程中6-BA的濃度不應(yīng)過高。因此，生長調(diào)節(jié)劑的最佳組合為1.0 mg L-16-BA+0.2 mg L-1KT，此時(shí)增殖系數(shù)為7.58。

表1 油莎豆叢芽增值L9(3)4正交試驗(yàn)直觀分析表Table1 Visual analysis of the L9(3)4orthogonal experiment of Cyperus esculentus proliferattion

表2 油莎豆叢生芽增殖的方差分析Table2 Variance analysis of clump shoot proliferation of Cyperus esculentus

圖2 油莎豆叢生芽增殖系數(shù)與生長調(diào)節(jié)劑水平的效應(yīng)曲線Fig.2 Effect curve between level of growth regulator and proliferation coefficient of Cyperus esculentus

2.3 生根培養(yǎng)

將叢生芽移至生根培養(yǎng)基中，芽能正常生長,沒有新的叢生芽增殖，2～3 d開始生根。從表3可見,不加任何生長調(diào)節(jié)劑，MS培養(yǎng)基的生根率和平均生根數(shù)均高于1/2MS培養(yǎng)基的，而添加0.1 mg L-1IBA或NAA的情況則相反。從圖4可見，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的根較為細(xì)長，雖然添加0.1 mg L-1NAA的培養(yǎng)基(R3,R6)平均生根數(shù)較多，但是根短而粗。綜合來看，最優(yōu)生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,生根率可達(dá)88.10%，平均生根數(shù)為2.04。

3 討論

對于主要通過營養(yǎng)塊莖、球莖、塊根等繁殖的植物，如山藥(Rhizoma dioscorea)、半夏(Pinellia ternata)、木薯(Manihot esculenta)等，傳統(tǒng)繁殖方式不僅擴(kuò)繁速度慢，耗費(fèi)種莖多，成本高，且長期營養(yǎng)繁殖容易積累病害，以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的離體快繁是目前最廣泛和最有效的一種高效繁育種苗和優(yōu)化種質(zhì)資源的技術(shù)。正交試驗(yàn)是多因素多水平分析的有利工具，可用最少的處理組合數(shù)來研究較多的試驗(yàn)因素。本研究同時(shí)分析了3種因素3個(gè)水平對油莎豆無菌苗增殖的影響，若不采用正交設(shè)計(jì)的方法，則需安排33=27組試驗(yàn)，采用正交設(shè)計(jì)只需要9組試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)方法已在北蒼術(shù)(Atractylodes chinensis)[8]、金線蓮(Anoectochilus roxburghii)[9]、山薯(Dioscorea fordii)[10]、康乃馨(Dianthus caryophyllus)[11]、空心蓮子草(Alternanthera philoxeroides)[12]等植物組織培養(yǎng)中成功應(yīng)用。

圖3 油莎豆叢生芽培養(yǎng)4周的生長情況。S1～S9見表1。Fig.3 Growth of clump shoots of Cyperus esculentus cultured for 4 weeks.S1-S9 see Table1.

表3 油莎豆叢生芽的生根培養(yǎng)Table3 Root induction of clump shoots of Cyperus esculentus

圖4 油莎豆叢生芽的生根。R1～R6見表3。Fig.4 Rooting of clump shoots of Cyperus esculentus.R1-R6 see Table3.

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、水平及組合對植物組織的增殖十分重要。細(xì)胞分裂素是植物組織培養(yǎng)過程中促進(jìn)組織分化和生長的物質(zhì)，不同細(xì)胞分裂素種類及濃度對組培苗的增殖效果不同[13-14]。本研究結(jié)果表明，對油莎豆叢生芽增殖影響最大的是6-BA,誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽較多，但植株不夠健壯；而KT誘導(dǎo)的叢生芽少，但生長較為健壯，這與張慧英等[15]對荸薺(Eleocharis tuberosa)的快繁研究結(jié)果一致。本研究中高濃度6-BA與KT配合使用并未達(dá)到叢生芽多且生長健壯的效果，可能與KT的濃度有關(guān)，這有待進(jìn)一步的研究。

韓曉勇等[16]報(bào)道MS+0.5mgL-16-BA+0.1mgL-1NAA培養(yǎng)基對鐵棍山藥莖段的不定芽誘導(dǎo)效果較好，豐鋒等[17]認(rèn)為MS+2.5 mg L-1KT+0.04 mg L-1NAA培養(yǎng)基對淮山藥繼代增殖培養(yǎng)效果較好，蔡建榮[18]報(bào)道MS+6-BA0.5 mg L-1+NAA0.1～0.5 mg L-1培養(yǎng)基較適合寸金薯莖段的不定芽誘導(dǎo)，潘梅等[19]認(rèn)為MS+2.0 mg L-16-BA+0.3 mg L-1NAA對‘桂淮6號’的不定芽增殖效果最好。這說明對同一物種不同基因型叢生芽增殖所需的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度存在一定的差異。目前對油莎豆的組織培養(yǎng)研究報(bào)道很少，瞿萍梅等[7]認(rèn)為油莎豆增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg L-16-BA，而本研究結(jié)果表明MS+1.0 mg L-16-BA+0.2 mg L-1KT培養(yǎng)基對油莎豆叢生芽繼代增殖較好，這可能與試驗(yàn)材料的基因型不同有關(guān)。

瞿萍梅等[7]報(bào)道油莎豆的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg L-1IBA，吳瓊[20]認(rèn)為油莎豆只能在1/2MS培養(yǎng)基中生根，而本研究結(jié)果表明，油莎豆叢生芽可以在MS培養(yǎng)基上生根，這可能與試驗(yàn)材料的基因型差異有關(guān)，說明本試驗(yàn)建立的油莎豆無菌苗快速繁殖體系需根據(jù)油莎豆的不同基因型做進(jìn)一步的調(diào)整，但本快繁系統(tǒng)叢生芽誘導(dǎo)時(shí)間短,數(shù)量較多，生長較健壯，生根誘導(dǎo)時(shí)無需添加任何生長調(diào)節(jié)劑，成本較低，可為油莎豆優(yōu)質(zhì)種苗的高效繁育及其種質(zhì)資源的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。