蘇華香,鄭潔旋,張會(huì),何金實(shí),簡曙光,夏快飛,陳建通,張美*

(1.中國科學(xué)院華南植物園，廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,海口 570228)

厚藤(Ipomoea pes-caprae)是廣泛分布于熱帶亞熱帶濱海地區(qū)的多年生藤本鹽生植物，隸屬于旋花科(Convolvulaceae)番薯屬[1]。厚藤抗逆性強(qiáng)，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和水分的利用效率極高，具有良好的固沙能力和耐海水沖刷能力，在島礁防風(fēng)固沙、綠化及生態(tài)重建等方面發(fā)揮重要作用[2]。厚藤作為優(yōu)異的野生植物資源，具有較大的開發(fā)潛力及應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也可作為一種研究植物抗逆分子機(jī)理、發(fā)掘抗逆基因的材料進(jìn)行深入研究。

脫水素(dehydrin,DHN)是植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)家族成員，該家族蛋白通常富含較高比例的親水性氨基酸，是一類高度穩(wěn)定的親水性蛋白[3]。研究表明，LEA基因(包括脫水素基因)通常在植物組織遭遇缺水脅迫時(shí)廣泛誘導(dǎo)表達(dá)，在種子發(fā)育晚期的脫水過程中，以及植物組織遭受高鹽、干旱、冷凍基因ABA處理時(shí)表達(dá)上調(diào)[4]。脫水素可歸于LEA_II類蛋白[5]，目前已經(jīng)鑒定的植物脫水素蛋白的分子量為9～200 kDa[6-7]，且通常含有1～3種具有不同重復(fù)的保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)各個(gè)保守序列在蛋白中的分布數(shù)目，脫水素可分為Kn、SKn、KnS、YnKn和YnSKn(n表示重復(fù)數(shù))[8]5個(gè)亞組。

有研究表明，當(dāng)植物遭受能導(dǎo)致細(xì)胞脫水的相關(guān)逆境時(shí)，如高滲透壓或高鹽脅迫以及冷凍時(shí)，脫水素基因都能夠在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)[9]。脫水素基因針對(duì)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是該類基因行使其正常的生物學(xué)功能的第一步，而基因的轉(zhuǎn)錄主要決定于其啟動(dòng)子序列。脅迫誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子通常含有多個(gè)/種脅迫調(diào)控的順式作用元件，包括ABA應(yīng)答元件 ABRE(ABA-responsive elements)，C-重復(fù) /干旱應(yīng)答/低溫應(yīng)答元件CRT/DRE/LTRE(C-repeat/drought-responsive/low-temperature-responsiveelement),轉(zhuǎn)錄因子MYB或MYC結(jié)合元件MYBPE/MYCPE(myeloblastosis/myelocytomatosispromoter elements)[8]。如黃瓜(Cucumis sativus)[9]、葡萄(Vitis vinifern)[10-11]、小麥(Triticum aestivum)[12]、大麥(Hordeum vulgare)[13]的脫水素基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)不同逆境脅迫應(yīng)答元件，并且這些脫水素基因的表達(dá)均受到相應(yīng)的脅迫環(huán)境的調(diào)控。綜上所述，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件的影響，而鑒定具有特定逆境脅迫應(yīng)答元件的啟動(dòng)子在逆境脅迫的植物遺傳改良中具有重要的應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已經(jīng)克隆了厚藤脫水素的cDNA序列，并根據(jù)其cDNA序列發(fā)掘出該基因?qū)?yīng)的基因組序列。實(shí)時(shí)定量RT-PCR表明IpDHN是一個(gè)受脅迫誘導(dǎo)的耐鹽耐旱功能基因[14]。據(jù)此,本試驗(yàn)擬通過染色體步移法克隆厚藤IpDHN基因的啟動(dòng)子序列，分析啟動(dòng)子中的順式作用元件，進(jìn)一步構(gòu)建IpDHN-Pro/pBI101.2植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥植株，探討啟動(dòng)子的表達(dá)模式，為啟動(dòng)子序列應(yīng)用于針對(duì)高鹽/干旱脅迫的植物轉(zhuǎn)基因育種和培養(yǎng)高鹽/干旱抗逆作物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

厚藤(Ipomoea pes-caprae)的成年植株取材于中國科學(xué)院華南植物園溫室群(23°18′75.91″N,113°37′02.38″E)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態(tài)型為Col-0，栽培溫度25℃，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度為 120～150μmol m-2s-1，光暗周期為 16 h/8 h。大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α，植物表達(dá)載體pBI101.2和農(nóng)桿菌株GV3101均為本實(shí)驗(yàn)室保存。載體構(gòu)建所需要的克隆載體pGEM T購于Promega(上海)公司，基因側(cè)翼序列擴(kuò)增所用的試劑盒為Genome Walking Kit(TaKaRa Bio USA)。載體無縫克隆所用的In-Fusion HD Cloning Kit購于Clontech(TaKaRa Bio USA)公司。總RNA的提取依照 HiPure Plant RNA Kits(Magen)的說明書進(jìn)行。cDNA鏈的合成依照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金公司)進(jìn)行。qRTPCR反應(yīng)參照 TransStart?Top Green qPCR Super-Mix(全式金公司)進(jìn)行。其他試劑及儀器均為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用試劑及設(shè)備。

1.2 方法

基因組DNA的提取取健康生長的厚藤小苗葉片0.1 g，放入研缽中加入液氮研磨至粉末，采用北京天恩澤基因科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒One-Tube Plant DNAOUT(貨號(hào)：60705)提取基因組DNA。采用電泳檢測和紫外分光光度計(jì)的方法檢測基因組DNA的純度和濃度，并用ddH2O將DNA的濃度調(diào)整至100 ngμL-1。

IpDHN基因組序列的獲取根據(jù)厚藤IpDHN的cDNA閱讀框序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)DHNF和DHNR(5′-ATGGCGGAGGAGTGCCACC-3′和 5′-TTAATGGCATTCCCCACCCTT-3′)，以厚藤基因組DNA為模板，擴(kuò)增IpDHN的基因組序列。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從PCR產(chǎn)物中挑選明亮條帶，依照Magen公司HiPure Gel Pure DNAKits說明書進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收，并連接于T載體上。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，送生物公司進(jìn)行測序。

IpDHN基因5′側(cè)翼序列的克隆根據(jù)IpDHN基因的基因組序列，參照Genome Walking Kit的操作指南，設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性引物SP1：5′-TCCTTATACTCCACCCCATG-3′和 SP2：5′-GCAGTGGGGCTTCTTCTCCT-3′。以厚藤基因組DNA為模板，用SP1、SP2對(duì)應(yīng)染色體步移的第1、2輪隨機(jī)引物進(jìn)行染色體步移克隆IpDHN基因5′側(cè)翼序列。兩輪PCR結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從PCR產(chǎn)物中挑選明亮條帶，依照Magen公司HiPure Gel Pure DNAKits說明書進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收，并連接于T載體上。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，送生物公司進(jìn)行測序,并保存正確質(zhì)粒(命名為IpDHN-Pro-pGEMT)備用。

生物信息學(xué)分析采用啟動(dòng)子分析數(shù)據(jù)庫PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和植物順式作用元件分析數(shù)據(jù)庫PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)對(duì)IpDHN基因的5′側(cè)翼序列進(jìn)行啟動(dòng)子功能預(yù)測及順式作用元件進(jìn)行分析。

IpDHN-Pro::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲取以厚藤基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物IpDHNProF：5′-CGACTCTAGAGGATCCCAGTGGGGCTTCTTCTCCT-3′和 IpDHNProR：5′-ACCTACCCGGGGATCCGCTCCTCCGCAGGCTTCTG-3′對(duì)厚藤脫水素基因IpDHN的啟動(dòng)子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(下劃線表示BamHI酶切位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收；同時(shí)采用BamHI單酶切處理植物表達(dá)載體pBI101.2，回收線性化質(zhì)粒。回收后IpDHNPRO啟動(dòng)子PCR片段和線性化pBI101.2質(zhì)粒經(jīng)Nanodrop公司紫外分光光度計(jì)測定濃度，采用無縫克隆技術(shù)進(jìn)行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定為正確的陽性克隆后，命名為IpDHN-Pro/pBI101.2,保存質(zhì)粒備用。經(jīng)測序分析正確后，IpDHN-Pro/pBI101.2重組質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。以野生型擬南芥作為轉(zhuǎn)基因材料，采用花序侵染的方法，通過GV3101農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥。將所獲得的擬南芥轉(zhuǎn)基因T3代種子放于含有50μgmL-1卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。獲取T3代純合體擬南芥進(jìn)行后續(xù)分析。

IpDHN-Pro的轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證取生長10 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代植株和開花擬南芥的不同部位,置于GUS染色反應(yīng)液中處理3 h以上，采用組織化學(xué)法進(jìn)行染色檢測，之后用95%的乙醇退色48 h后利用LEICADM2500體式顯微鏡拍照。配制1 mL的GUS染液可以按照以下操作進(jìn)行，即取1.5mL的空離心管，首先加入309μL的ddH2O，再依次加入500μL 0.2 mol L-1的磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)，1μL 的 Triton X-100，10μL的50mmolL-1亞鐵氰化鉀溶液，10μL的50mmolL-1鐵氰化鉀溶液，20μL0.2molL-1的EDTANa2溶液(pH7.0)，100μL的甲醇，以及50μL10mgmL-1X-Gluc溶液(溶于二甲基甲酰胺)，并充分混勻。

IpDHN-Pro對(duì)脅迫和激素信號(hào)的響應(yīng)取生長10 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代植株(MS培養(yǎng)基平板上)，分別加入200 mmol L-1NaCl、300 mmol L-1甘露醇和0.1 mmol L-1ABA進(jìn)行高鹽、滲透壓和激素處理24 h，以ddH2O處理的幼苗為對(duì)照，取幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色并拍照。收集處理的擬南芥小苗各0.5 g提取總RNA，采用兩步法以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)羅氏熒光定量PCR LightCycler480使用方法進(jìn)行Real time RT-PCR，檢測GUS基因的表達(dá)情況。GUS基因的引物為GUSRTF：5′-ACGGGGAAACTCAGCAAGC-3′和 GUSRTR：5′-TGAGCGTCGCAGAACATTACAT-3′。內(nèi)參基因?yàn)閿M南芥肌動(dòng)蛋白基因AtACT2(At3g 18780)。AtACT2基因的引物為ACT2-RTF：5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′和 ACT2-RTR：5′-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3′。qRT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃15 s，60℃35 s，40次循環(huán)，繪制溶解曲線。采用Excel 2003統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，樣本的Ct值取3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果和分析

2.1 IpDHN啟動(dòng)子IpDHN-Pro的克隆

根據(jù)厚藤IpDHN的cDNA序列，在起始密碼子和終止密碼子處設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得IpDHN序列片段。回收片段連接于T載體上測序，并和IpDHN的cDNA序列閱讀框進(jìn)行比較，可知IpDHN序列中含有1個(gè)264bp的內(nèi)含子序列(圖1)。

采用染色體步移法設(shè)計(jì)基因特異引物SP1和SP2,參考Genome Walking Kit說明書，以厚藤基因組DNA為模板，經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增獲得1條明亮的DNA條帶，大小約為1 kb(圖2)。

圖1 IpDHN基因序列。陰影部分為IpDHN基因的內(nèi)含子；下劃線分別為引物SP2和SP1序列。Fig.1 Sequence of IpDHN.The sequence in gray is the intron,and the underlined sequences are primers SP2 and SP1.

圖2 IpDHN啟動(dòng)子片段的PCR 擴(kuò)增。1：標(biāo)準(zhǔn)DNA；2：第一輪PCR：3：第二輪PCR。Fig.2 PCR of IpDHN promoter.1：Standard DNA marker；2：The first PCR；3：The second PCR.

將該片段回收后連接于T載體上測序，即獲得長度為974 bp的IpDHN的5′側(cè)翼啟動(dòng)子序列,將其輸入在線分析軟件PlantCARE和PLACE,該序列除了含有真核生物轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)核心元件TATA-box(TATA盒)和CAAT-box(CAAT盒)外，還存在一些其他的順式作用元件(圖3)。起始轉(zhuǎn)錄必需的TATA-box位于起止密碼子ATG上游178個(gè)堿基處(-178 bp)；而調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始頻率的CAAT-box位于起止密碼子ATG上游140個(gè)堿基處(-140 bp)。在ATG上游48個(gè)堿基處(-48 bp)含有1個(gè)脫落酸應(yīng)答元件(abscisic acid-response element；ABRE；TACGTG)；而在 ATG上游52、718和925個(gè)堿基處(-52、-718和-925 bp)還有3個(gè)Myb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(myeloblastosisbinding sites,MBS1和 MBS2；CGGTCA 或 CAACTG)；ATG上游767個(gè)堿基處(-767 bp)含有植物防御反應(yīng)相關(guān)的富含TC的重復(fù)序列(TC-rich repeat regulatory element；ATTTTCTCCA)。此外，在 ATG上游246個(gè)堿基處(-246 bp)含有一個(gè)種子胚乳特異表達(dá)的順式作用元件Skn-1基序(Skn-1 motif；GTCAT)。

2.2 啟動(dòng)子IpDHN-Pro的起始轉(zhuǎn)錄活性

為探明IpDHN-Pro序列是否具有轉(zhuǎn)錄活性，將IpDHN-Pro連接至植物啟動(dòng)子表達(dá)載體pBI101.2中，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，驗(yàn)證其是否在擬南芥中具有啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的活性。選取經(jīng)卡那霉素篩選的T3代純合體轉(zhuǎn)基因擬南芥，分別對(duì)其根、莖、葉、花、莢果和幼苗進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明(圖4)，GUS陽性信號(hào)在擬南芥的主根中最強(qiáng)，在蓮座葉的葉中也有一定的表達(dá)，而在幼苗的下胚軸中幾乎不表達(dá)；在成年植株葉片上有顯色，且表達(dá)量一般；在花序中有較低的表達(dá)，在發(fā)育角果的基部和頂端有較強(qiáng)的表達(dá)。這說明該啟動(dòng)子可能屬于根、葉豐富的啟動(dòng)子，在擬南芥中具備轉(zhuǎn)錄活性且正常生長條件下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性較低。

圖3 啟動(dòng)子IpDHN-Pro序列和順式作用元件Fig.3 Sequence of IpDHN-Pro and the cis-acting elements

圖4 轉(zhuǎn)IpDHN-Pro/pBI101.2擬南芥植株GUS組織染色。A：幼苗；B：真葉；C：主根；D：葉片；E：花序；F：角果。Fig.4 GUS staining of transgenic Arabidopsis with IpDHN-Pro/pBI101.2.A：Seedling；B：True leaves；C：Axial root；D：Leaf；E：Inflorescence；F：Silique.

2.3 啟動(dòng)子IpDHN-Pro轉(zhuǎn)錄活性的影響因素

為進(jìn)一步探索IpDHN-Pro的功能，對(duì)轉(zhuǎn)IpDHNPro/pBI101.2擬南芥進(jìn)行高鹽、干旱、外源激素ABA等脅迫處理，然后進(jìn)行GUS染色。在未經(jīng)處理的對(duì)照擬南芥幼苗中，GUS陽性信號(hào)較弱,但經(jīng)200mmolL-1NaCl、300mmolL-1甘露醇和 0.1mmolL-1ABA分別處理24 h后，擬南芥幼苗的GUS信號(hào)明顯增強(qiáng)(圖5)，這表明在高鹽、干旱和外源激素ABA處理下，IpDHN-Pro啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性有所增強(qiáng)，造成葡萄糖苷酸酶GUS在植株體內(nèi)活性增強(qiáng)。

為了證明GUS活性的增強(qiáng)是由于GUS基因的表達(dá)上調(diào)引起的，我們同時(shí)采用qRT-PCR方法分析了脅迫處理后的擬南芥幼苗GUS基因表達(dá)情況。在高鹽、高滲透壓和外源激素ABA處理下GUS基因的表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)量分別上調(diào)了4、2和2倍(圖6)。這進(jìn)一步證明，在啟動(dòng)子IpDHN-Pro的控制下,GUS基因的表達(dá)受到了高鹽、干旱和外源激素ABA等脅迫的誘導(dǎo)，即我們所克隆獲得的厚藤脫水素IpDHN基因中974 bp的5′側(cè)翼序列為啟動(dòng)子序列,具有起始轉(zhuǎn)錄的活性，且其調(diào)控GUS基因的轉(zhuǎn)錄受高鹽、干旱、外源激素ABA等脅迫的上調(diào)影響。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在脅迫處理24 h后的GUS活性。A：對(duì)照；B：200 mmol L-1NaCl；C：300 mmol L-1 甘露醇；D：0.1 mmol L-1ABA。Fig.5 GUS activity in transgenic Arabidopsis seedlings under stress for 24 h.A：Control；B：200 mmol L-1NaCl；C：300 mmol L-1mannitol；D：0.1 mmol L-1ABA.

圖6 qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗脅迫處理24 h后GUS基因的表達(dá)。1：對(duì)照；2：200 mmol L-1NaCl；3：300 mmol L-1 甘露醇；4：0.1 mmol L-1 ABA。**：P＜0.01。Fig.6 Expression of GUS in transgenic Arabidopsis seedlings under stress by qRT-PCR.1：Control；2：200 mmol L-1NaCl；3：300 mmol L-1mannitol；4：0.1 mmol L-1ABA.**：P＜0.01.

3 討論

脫水素基因是植物體內(nèi)受鹽、干旱脅迫誘導(dǎo)的抗逆標(biāo)志基因[3,8,15]，有大量研究證明該類基因與植物耐鹽、耐旱、抗凍等抗逆性密切相關(guān)[16]。高鹽和干旱是植物生長過程中最常見的逆境脅迫，通常會(huì)引起植物失水，造成細(xì)胞內(nèi)水平衡失衡，進(jìn)而影響植物的生長和發(fā)育。對(duì)于農(nóng)作物而言，由于高鹽和干旱引起的農(nóng)作物生長不良，進(jìn)而造成農(nóng)作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的常見問題。因此,在植物基因工程育種中，通過上調(diào)一些抗逆基因的表達(dá)，提高植物或作物的抗逆性，是一種最為行之有效的方法。

啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的主要因素，而啟動(dòng)子序列所包含的順式作用元件通常能夠決定該基因的轉(zhuǎn)錄受哪些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，并在何種情況下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或改變轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。我們的前期研究表明，厚藤IpDHN基因是一個(gè)典型的受鹽旱等非生物脅迫及ABA誘導(dǎo)的抗逆功能基因[14]，結(jié)合厚藤這一物種的極端耐鹽耐旱性，我們推測IpDHN基因的表達(dá)調(diào)控可能在厚藤抗逆性中發(fā)揮了重要作用?；谝陨霞僭O(shè)，本研究克隆并分析了IpDHN基因的啟動(dòng)子序列，為深入了解厚藤的抗逆生物學(xué)特征奠定基礎(chǔ)，也為植物抗逆遺傳工程提供了可操作的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前，鹽生植物已成為克隆耐鹽基因和鹽害誘導(dǎo)啟動(dòng)子的主要來源[17]。厚藤是一種典型的熱帶亞熱帶鹽生植物，我們通過對(duì)厚藤IpDHN基因的啟動(dòng)子區(qū)域(974 bp)進(jìn)行鑒定，其含有多個(gè)與植物非生物逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，如ABRE、MBS以及富含TC的重復(fù)調(diào)控元件等。ABRE是ABA信號(hào)中關(guān)鍵的基因轉(zhuǎn)錄順式應(yīng)答元件[18]，廣泛參與調(diào)控植物功能基因應(yīng)答ABA信號(hào)及滲透壓脅迫[19-20]。MBS主要通過與轉(zhuǎn)錄因子MYB結(jié)合，而很多MYB轉(zhuǎn)錄因子均與植物應(yīng)答干旱脅迫和ABA信號(hào)密切相關(guān)[21-22]。富含TC的重復(fù)調(diào)控元件主要參與調(diào)控植物防御反應(yīng)和抗逆應(yīng)答[23]，暗示了IpDHN基因的啟動(dòng)子序列IpDHN-Pro具備廣泛抗逆應(yīng)答特征。PlantCARE軟件預(yù)測結(jié)果表明，IpDHN-Pro序列還存在1個(gè)胚乳誘導(dǎo)表達(dá)元件Skn-1[24]，表明IpDHN基因能夠在種子發(fā)育后期胚乳發(fā)育中表達(dá)，符合IpDHN基因作為LEA基因家族成員這一基本特征。

本研究還成功獲得IpDHN-Pro調(diào)控GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。通過對(duì)擬南芥不同組織部位的化學(xué)染色分析，IpDHN-Pro具有在擬南芥中廣泛調(diào)控基因表達(dá)的特征，但正常生長條件下，GUS表達(dá)水平較低，表明我們所克隆的IpDHN-Pro序列具備基本的起始基因轉(zhuǎn)錄功能，是一個(gè)有活性的啟動(dòng)子；通過對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行高鹽、滲透壓脅迫及ABA處理，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的GUS染色活性增強(qiáng)；同時(shí)qRT-PCR分析表明GUS的表達(dá)顯著增強(qiáng)。這表明IpDHN-Pro啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)外源GUS基因受干旱或高鹽和外源激素ABA的誘導(dǎo)。同時(shí)，也驗(yàn)證了前期對(duì)厚藤IpDHN基因表達(dá)研究的結(jié)論[14]。

本研究通過對(duì)克隆獲得的974 bp的IpDHN基因的5′側(cè)翼序列進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，鑒定出一部分可能的啟動(dòng)子順式作用元件。通過轉(zhuǎn)基因和GUS組織化學(xué)染色研究，闡明了該啟動(dòng)子序列具有起始基因轉(zhuǎn)錄的功能，證明IpDHN-Pro序列驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥的不同組織中表達(dá)有差異,以下胚軸、主根和葉片中的表達(dá)較強(qiáng)，在角果中的表達(dá)微弱，而在花序中幾乎無表達(dá)，是1個(gè)根和葉豐富表達(dá)的啟動(dòng)子；GUS染色試驗(yàn)進(jìn)一步證明該啟動(dòng)子能夠在高鹽、干旱和外源激素ABA等脅迫下增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)GUS活性；qRT-PCR分析表明IpDHN-Pro序列驅(qū)動(dòng)的GUS基因的表達(dá)受高鹽、干旱和外源激素ABA誘導(dǎo)，均不同程度的上調(diào)表達(dá)。這為植物抗逆遺傳工程育種中利用特定脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控植物抗逆性奠定理論基礎(chǔ)。