張麗華，趙鵬 ，張婷婷 ，杜永鵬

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712046； 2.咸陽(yáng)市麗彩醫(yī)藥有限公司，咸陽(yáng) 712046)

化香樹(shù)是胡桃科(StrobilaceaSieb.etZucc)植物，應(yīng)用干燥果序入藥，具有清熱瀉火、消除腫痛等功效，可用于治療鼻炎等疾病[1]。多酚、黃酮、多糖等是化香樹(shù)果序的活性成分[2-4]。其中多糖含有良好的抗氧化性，但關(guān)于其提取、分離純化工藝研究很少。鑒于多糖又是中藥中基本上都含有的活性成分，并在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤、衰老等方面能起到一定的藥理作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)主要是控制單因素變量，利用超聲輔助對(duì)化香樹(shù)果序多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。中藥內(nèi)許多有效成分均需要破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)才能釋放出來(lái)，現(xiàn)有的科學(xué)方法很難達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求破除細(xì)胞的效果。超聲提取法可以通過(guò)三大效應(yīng)分裂細(xì)胞，使得溶劑進(jìn)入藥材或把藥材的化學(xué)成分?jǐn)U散到細(xì)胞外，再通過(guò)分離純化的方法進(jìn)行相關(guān)成分提取，從而可以提高破碎的效果。超聲提取的優(yōu)點(diǎn)有提取時(shí)間短、提取率高、節(jié)省材料等，這些優(yōu)點(diǎn)使其在中藥提取中得到了廣泛的應(yīng)用[8-11]。

1 試劑與儀器

1.1試劑 化香樹(shù)果序、葡萄糖(AR)、濃硫酸(AR)、無(wú)水乙醇(95%)(AR)、苯酚(AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，化香樹(shù)果序藥材購(gòu)自西安萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng)，經(jīng)藥學(xué)院趙鵬教授鑒定為化香樹(shù)屬植物化香樹(shù)的果序。

1.2儀器 EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀-上海愛(ài)朗儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵-鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；VOSHIN-1500C低溫超聲波萃取儀-無(wú)錫沃信儀器制造公司；電子天平(梅特勒-托利多有限責(zé)任公司，感量：0.01 mg)。

2 方法與結(jié)果

2.1提取工藝流程 首先，把經(jīng)干燥處理的化香樹(shù)果序用粉碎機(jī)粉碎，并過(guò)篩孔內(nèi)徑0.250 mm篩。 其次，把粉末進(jìn)行脫脂，使用無(wú)水乙醇(95%)進(jìn)行處理。再次，把水和脫脂后的粉末進(jìn)行混合，并用超聲輔助浸提3次進(jìn)行過(guò)濾，將濾液按照生藥體積比1：1進(jìn)行濃縮，然后加入無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。過(guò)夜，把溶液抽濾，再進(jìn)行干燥，獲得化香樹(shù)果序粗多糖。見(jiàn)圖1。

2.2多糖含量與提取率 應(yīng)用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[5]。準(zhǔn)確稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖25 mg，置于25 mL量瓶中，加純化水定容，得到1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于具塞試管中，加水定容至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，再于沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫；以未加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)490 nm下應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，多糖濃度為橫坐標(biāo)，將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，可以得到的方程為：A=0.010 3C+0.000 4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，濃度范圍是0～50 μg·mL-1，線性關(guān)系良好。多糖提取率的計(jì)算用下式：多糖提取率(%)=(提取物質(zhì)量×多糖的含量/原料質(zhì)量)×100% (1)

準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)所得粗多糖干燥品10 mg，置于50 mL量瓶，用少量蒸餾水溶解后定容，準(zhǔn)確移取多糖溶液0.2 mL，依據(jù)苯酚-硫酸法測(cè)得吸光度，代入直線方程算出粗多糖的百分含量，再由式(1)算出多糖的提取率。

圖1 粗多糖提取工藝示意圖

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 響應(yīng)面分析方法是一種優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)計(jì)方法，用于解決非線性數(shù)據(jù)處理的問(wèn)題[12]。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Box-Behnken Design設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Design -Expert v7.1.3軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，進(jìn)行多元二次回歸方程數(shù)據(jù)擬合，繪制響應(yīng)曲面和等高線圖，分析預(yù)測(cè)得到較優(yōu)工藝參數(shù)。Design -Expert v7.1.3軟件是專業(yè)響應(yīng)面分析軟件，能夠大大減少所需要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，提高實(shí)驗(yàn)效率。響應(yīng)面法相對(duì)于正交實(shí)驗(yàn)法，精密度高、預(yù)測(cè)值接近真實(shí)值，結(jié)果更加合理、可靠。

2.4單因素分析

2.4.1超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 保持其他條件不變，用不同的超聲時(shí)間來(lái)觀察多糖提取率的變化，結(jié)果顯示，在超聲時(shí)間為40 min左右提取率的峰值最高之后趨于平緩，因此40 min是最佳提取的時(shí)間。見(jiàn)圖2。

2.4.2超聲功率對(duì)多糖提取率的影響 保持其他條件不變，用不同的超聲功率觀察多糖提取率的變化，結(jié)果顯示，在超聲功率250 W提取率為最高之后曲線下降，因此250 W是提取的最佳超聲功率。見(jiàn)圖3。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

Fig.2Effectsofultraphonictimeonextractionratioofpolysaccharides

圖3 功率對(duì)多糖提取率的影響

Fig.3Effectsofpoweronextractionratioofpolysaccharides

2.4.3溫度對(duì)多糖提取率的影響 保持其他條件不變，改變提取溫度來(lái)觀察多糖提取率，結(jié)果顯示，在提取溫度是50 ℃時(shí)，提取率曲線達(dá)到最高點(diǎn)之后下降。 因此50 ℃是提取的最佳溫度。見(jiàn)圖4。

2.4.4液料比對(duì)多糖提取率的影響 保持其他條件不變，改變液料比觀察多糖提取率的變化，結(jié)果顯示，當(dāng)液料比為25(mL·g-1)時(shí)，多糖提取率前上升且趨于平緩，因此25(mL·g-1)為最合適的料液比。見(jiàn)圖5。

圖4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

Fig.4Effectsoftemperatureonextractionratioofpolysaccharides

圖5 液料比對(duì)多糖提取率的影響

Fig.5Effectsoftheratioofwatertomaterialonextractionratioofpolysaccharides

2.4.5提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響 保持其他條件不變，改變提取次數(shù)來(lái)觀察多糖提取率的變化，結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)3次提取時(shí)多糖的提取率變化幅度逐漸平緩，所以3次是最佳的提取次數(shù)。見(jiàn)圖6。

圖6 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

Fig.6Effectsoftimesonextractionratioofpolysaccharides

2.5響應(yīng)面法優(yōu)化超聲工藝

2.5.1響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，討論單因素條件下的的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出在3次提取次數(shù)，25(mL·g-1)的液料比下，選取時(shí)間、超聲功率和溫度這3個(gè)因素對(duì)化香樹(shù)果序多糖提取率影響顯著，因此需要進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析[12]。結(jié)果顯示，通過(guò)Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到的模型顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05(P=0.001 3)，說(shuō)明該模型是基本正確的。從失擬性檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，失擬誤差很小(P=0.4336)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中的未知因素對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小，預(yù)測(cè)的回歸模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合得較好。而且預(yù)測(cè)模型的R2=0.977 9，說(shuō)明提取率的實(shí)驗(yàn)值與其預(yù)測(cè)值之間相一致，該模型的變異系數(shù)CV=1.45%(<5%)，校正系數(shù)R2Adj= 0.938 0這說(shuō)明預(yù)測(cè)的模型能反映93.80%響應(yīng)值的變化，因此通過(guò)回歸方程能夠預(yù)測(cè)真實(shí)的數(shù)據(jù)，并對(duì)真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在對(duì)各個(gè)單因素分析中，超聲功率對(duì)化香樹(shù)果序多糖提取率影響最大，其次是提取溫度，超聲時(shí)間影響程度最小，但超聲時(shí)間與提取溫度之間的相互影響最明顯。根據(jù)Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到的回歸方程為：

Y=3.82-0.023X1+0.16X2+0.054X3+0.032X1X2+0.16X1X3-0.032X2X3-0.20X12-0.1X22-0.16X32(2)

見(jiàn)表1-3。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

Tab.1Factorsandlevelsofresponsesurfaceanalysis

水平超聲時(shí)間X1(A)/min超聲功率X2(B)/W溫度X3(C)/ ℃-135200400402505014530060

A=(X1-40)/5，B=(X2-250)/50，C=(X3-50)/10

A=(X1-40)/5，B=(X2-250)/50，C=(X3-50)/10

2.5.2等高線圖和響應(yīng)面圖分析 結(jié)果顯示，超聲功率總體趨勢(shì)比較陡峭，即影響是最明顯的；而溫度的總體趨勢(shì)較為平緩，即影響較??； 提取時(shí)間的影響最小。得到回歸模型方程一階數(shù)據(jù)：X1= 0.05，X2=0.65，X3=0.2；所以預(yù)測(cè)最佳的工藝提取條件為：超聲時(shí)間為40.25 min，超聲功率是282.5 W，提取溫度52 ℃，多糖提取率是3.973%。見(jiàn)圖7-9。

2.5.3驗(yàn)證比較實(shí)驗(yàn) 根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作的情況，將提取工藝條件調(diào)整為：超聲時(shí)間40 min，超聲功率290 W，提取溫度52 ℃，液料比25(mL·g-1)，3次提取；并在這樣的條件下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證，多糖平均提取率為3.959%，和預(yù)測(cè)的提取率的結(jié)果相一致，這表示應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化分析的結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)的要求；而與傳統(tǒng)水提法比較，超聲法所用提取時(shí)間明顯縮短，提取率較高。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

Tab.2ProgramandresponsevalueofBox-Behnken

實(shí)驗(yàn)序號(hào)ABC提取率/%10-113.48620-1-13.339310-13.18241-103.31851103.72860113.7077-10-13.6028-1103.665901-13.68610-1-103.371110003.801121013.633130003.875140003.79115-1013.413

表3 方差分析

* Pr>F值小于0.05為顯著；** Pr>F值小于0.0001為高度顯著

* Pr>F value less than 0.05 is significant; ** Pr>F value less than 0.0001 is highly significant

圖7 時(shí)間與功率對(duì)多糖提取率的影響

Fig.7Effectoftimeandpoweronextractionratioofpolysaccharides

圖8 溫度與時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

Fig.8Effectoftemperatureandtimeonextractionratioofpolysaccharidesofpolysaccharides

圖9 溫度與功率對(duì)多糖提取率的影響

Fig.9Effectoftemperatureandpoweronextractionratioofpolysaccharides

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)采取了超聲輔助化香樹(shù)果序多糖提取的最佳工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，最終得到了和數(shù)學(xué)模型相符合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和化香樹(shù)果序多糖提取最佳工藝條件，即為：超聲時(shí)間40 min，超聲功率290 W，提取溫度52 ℃，液料比25(mL·g-1)，提取次數(shù)3次，化香樹(shù)果序多糖的平均提取率可以達(dá)到3.959%。本次實(shí)驗(yàn)主要研究超聲輔助化香樹(shù)果序多糖提取最佳工藝條件，研究結(jié)果可為化香樹(shù)果序多糖進(jìn)一步深入研究及同類研究等提供參考。