鄭志昌 陳映彤 郭娟娟 徐 暉 鄭寶東 盧 旭

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州350002）

以非消化性碳水化合物為底物的糖化發(fā)酵和以非消化性蛋白質(zhì)為底物的致腐性發(fā)酵是大腸微生物在上消化道代謝生存的兩種基本方式。有研究表明，益生菌及剩余大腸微生物與非消化性碳水化合物間存在構(gòu)效關(guān)系，并非所有菌株都能等效地利用同一碳源，不同微生物對(duì)碳源的利用情況也存在顯著差異，這與菌群之間的糖苷水解酶差異，以及碳水化合物結(jié)構(gòu)特征息息相關(guān)[1-4]。非消化性低聚糖以及某些長(zhǎng)鏈多糖為膳食益生元，它們通過(guò)選擇性促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌增Px 的活力越高，呈現(xiàn)一定的量效殖，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，降低腸道pH 環(huán)境或作為腸道細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響[5-8]。目前，膳食性益生元被認(rèn)為是除抗生素和益生菌外，有效調(diào)節(jié)腸道菌群的天然膳食性成分。以酶法轉(zhuǎn)化或化學(xué)方法合成的低聚果糖（FOS）、反式低聚半乳糖（t-GOS）以及抗性淀粉（RS）等膳食纖維的益生功效已被廣泛認(rèn)可。作為自然界構(gòu)成和種類(lèi)最復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，許多來(lái)源于植物或大型真菌的天然碳水化合物普遍被證實(shí)具有潛在的益生元功能[9-11]。由于結(jié)構(gòu)新穎，同分異構(gòu)體廣泛存在，所以純化后不同組分的益生效果的構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究確定。

蓮子是中國(guó)傳統(tǒng)藥食兩用之佳品，含有豐富的碳水化合物成分，其直鏈淀粉含量高達(dá)40%，屬于高直鏈特異性淀粉[12]。此外，還含有其它天然非淀粉類(lèi)多糖、低聚糖等碳水化合物。蓮子中新發(fā)現(xiàn)的新型低聚糖主要包括2 種三糖及1 種四糖，由甘露糖、果糖或葡萄糖通過(guò)α-1，6 或α-1，2 糖苷鍵相連，三者能協(xié)同促進(jìn)雙歧桿菌和乳桿菌增殖和產(chǎn)生短鏈脂肪酸，而對(duì)于每種低聚糖單體的具體增菌效能未做深入研究[13-15]。益生指數(shù)（PI）是比較膳食低聚糖益生效應(yīng)的定量分析指標(biāo)之一[16]，可有效評(píng)估腸道菌群發(fā)酵過(guò)程中若干關(guān)鍵菌群相對(duì)數(shù)量的變化情況。本文通過(guò)小鼠腸道菌群體外發(fā)酵研究，比較3 種蓮子低聚糖（LOS）單體的益生效果差異，為蓮子低聚糖的構(gòu)效關(guān)系研究以及蓮子資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子低聚糖單體 （LOS3-1：Man-1→6-Glc-1→2-Fru、LOS3-2：Man-1→6-Man-1→6-Glc，化合物4 為L(zhǎng)OS4：Man-1→6-Man-1→6-Glc-1→2-Fru），采用中壓制備型制備色譜法制備，方法參照Lu 等[15]的方法。速凍鮮蓮，綠田（福建）食品有限公司。

低聚果糖，索萊寶科技有限公司；葡萄糖，國(guó)藥試劑廠；SPF 級(jí)雄性BALB/C 小鼠，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證編號(hào)：SCXK（滬）2012-002）；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸標(biāo)準(zhǔn)品，Aladin 試劑（上海）有限公司；選擇性培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Puri Flash-150 型制備色譜儀，法國(guó)Interchim公司；PHS-3C 型精密pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；7890 型氣相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；T6 新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧培養(yǎng)盒，日本三菱公司；QL-866 型旋渦混勻器，江蘇海門(mén)其利貝爾儀器制造有限公司；AL104 型精密分析天平，梅特勒-托利多儀器 （上海） 有限公司；SYQ-DSX-280B 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基（GAM）：動(dòng)物組織胃蛋白酶消化物10 g；大豆蛋白胨3 g；酪蛋白胨10 g；消化血清粉13.5 g；酵母浸膏5 g；牛肉膏2.2 g；牛肝粉1.2 g；葡萄糖3 g；KH2PO42.5 g；NaCl 3 g；可溶性淀粉5 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽0.3 g；硫基乙酸鈉0.3 g；蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.4 腸道菌群體外發(fā)酵

試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2012-0001），取適應(yīng)期結(jié)束后的新鮮小鼠糞便約0.5 g，用20 mL 無(wú)菌PBS（0.1 mol/L pH 7.4） 充分混勻作為腸道全菌群模板。以GAM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加5 mg/mL的蓮子低聚糖單體為碳源配制試驗(yàn)培養(yǎng)基，以添加等量的葡萄糖（Glc）和低聚果糖（FOS）分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。每組試驗(yàn)分裝20 mL GAM培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基初始pH 值用0.1 mol/L 的無(wú)菌NaOH 溶液將培養(yǎng)基調(diào)至pH 7.3±0.1，取小鼠新鮮糞便上清液0.5 mL 接入各培養(yǎng)基中，37 ℃氣浴搖床厭氧發(fā)酵，于0，6，12，18，24，36 h 分別取樣測(cè)定。

1.4.1 發(fā)酵液pH 值及菌體密度測(cè)定 取特定時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液，旋渦混勻器充分混勻5 s 后，以紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)OD 值，檢測(cè)波長(zhǎng)：600 nm。剩余菌液以8 000 r/min 離心5 min 后取上清液，采用精密pH 計(jì)測(cè)定發(fā)酵液pH 值。

1.4.2 發(fā)酵液短鏈脂肪酸（SCFAs）含量測(cè)定 參考耿梅梅等[17]的方法，略有修改。準(zhǔn)確移取2 mL上清液，加入0.5 mL 25%偏磷酸溶液，冰浴處理3 h，再次離心后經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行氣相色譜分析。色譜條件：HP-INNOWAX 色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；起始溫度：100 ℃，保持0.5 min，再以4 ℃/min 的升溫速度加熱至160 ℃，總過(guò)程運(yùn)行16.5 min。進(jìn)樣量0.2 μL，載氣為氮?dú)?，流?0 mL/min；燃?xì)鈿錃饬魉?0 mL/min，助燃?xì)饪諝饬魉?00 mL/min，尾吹氮?dú)饬髁?9 mL/min；FID 檢測(cè)器溫度240 ℃，進(jìn)樣口溫度240 ℃；采用不分流的方式。

1.4.3 發(fā)酵液NH3含量測(cè)定 參考Broderick 等[18]的方法，略有修改。準(zhǔn)確移取1 mL 上清液，加入0.5 mL 25%偏磷酸溶液，冰浴靜置30 min。吸取40 μL 樣品溶液于10 mL 試管，依次加入等量去離子水及2.5 mL 苯酚顯色劑，旋渦混勻后，再加入2 mL 次氯酸鹽試劑，混勻后37 ℃水浴10 min，于550 nm 下測(cè)定吸光度值。

1.4.4 益生指數(shù) 取發(fā)酵液100 μL 于15 mL 無(wú)菌離心管，用無(wú)菌PBS（pH=7.4，0.1 mol/L）溶液稀釋至合適的稀釋度，分別檢測(cè)雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、大腸桿菌以及細(xì)菌總數(shù)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單位為：lg CFU/mL。益生指數(shù)（PI）的計(jì)算公式如下：

PI =（Bif/Toal） -（Bac/Toal） +（Lac/Toal） -（E.Coli/Toal）

式 中，Bif，Bac，Lac，E.Coli，Toal——發(fā) 酵 液中特定時(shí)間點(diǎn)的雙歧桿菌、擬桿菌、乳桿菌、大腸桿菌以及細(xì)菌總數(shù)與其在糞便中原始數(shù)量的比值。

表1 培養(yǎng)基類(lèi)型及其培養(yǎng)條件Table 1 The culture medium and conditions of different bacteria

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液pH 值變化

腸道菌群發(fā)酵液的pH 值與細(xì)菌代謝物中的短鏈脂肪酸-無(wú)機(jī)氮化合物間的比例相關(guān)。測(cè)定添加不同碳源的小鼠腸道菌群發(fā)酵液的pH 值結(jié)果如圖1所示。在最初的12 h 內(nèi)，各組發(fā)酵液的pH值均迅速下降，其中以蓮子低聚糖為碳源的發(fā)酵液pH 值下降幅度最大，F(xiàn)OS 組次之，而Glc 組的下降幅度最小。12 h 后，F(xiàn)OS 組發(fā)酵液的pH 值繼續(xù)呈緩慢下降的趨勢(shì)，而其余各組則處于波動(dòng)狀態(tài)。

非消化性碳水化合物能夠被雙歧桿菌優(yōu)先利用，其本質(zhì)原因在于雙歧桿菌等益生菌的基因組中含有更多與非消化性碳水化合物代謝相關(guān)酶類(lèi)的基因片段[19]。添加蓮子低聚糖單體及FOS 發(fā)酵液pH 值下降更加顯著的原因可能在于通過(guò)促進(jìn)益生菌的增殖，增加短鏈脂肪酸產(chǎn)量，同時(shí)限制致腐微生物的發(fā)酵作用，減少無(wú)機(jī)氮化合物的生成。而FOS 相比蓮子低聚糖其發(fā)酵液pH 下降相對(duì)緩慢的原因可能與其聚合度較大，降解速度較慢有關(guān)。

2.2 發(fā)酵液菌體密度變化

發(fā)酵液的菌體密度可定性反映小鼠腸道菌群在不同碳源中生長(zhǎng)情況。如圖2所示，以Glc 為碳源的發(fā)酵液，菌體密度值上升速度最快，上升持續(xù)時(shí)間也最長(zhǎng)，達(dá)到18 h；這與Glc 可作為腸道菌群發(fā)酵的共同碳源優(yōu)先被利用并供菌體生長(zhǎng)繁殖有關(guān)，進(jìn)而造成菌體密度提高。在0～12 h 內(nèi)，以蓮子低聚糖和FOS 為碳源的發(fā)酵液菌體密度值沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）；LOS3-2、LOS4 及FOS 組的菌體密度在12～24 h 之間呈先下降后上升的趨勢(shì)，提示該段時(shí)間內(nèi)發(fā)酵液的細(xì)菌群落組成可能發(fā)生更替。在24～36 h 時(shí)期，各組發(fā)酵液的OD600值幾乎保持不變，導(dǎo)致菌體密度不再上升的原因可能是體系的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及細(xì)菌代謝物積累所致。

圖1 蓮子低聚糖對(duì)發(fā)酵液pH 值的影響Fig.1 Effect of LOS on pH value of broth

圖2 蓮子低聚糖對(duì)發(fā)酵液菌體密度的影響Fig.2 Effect of LOS on cell density of broth

2.3 發(fā)酵液SCFAs 含量

短鏈脂肪酸也被稱(chēng)之為揮發(fā)性脂肪酸（VFAs），是腸道菌群發(fā)酵碳水化合物的最終產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液中主要短鏈脂肪酸的含量，比較不同蓮子低聚糖的產(chǎn)酸量差異。結(jié)果如圖3所示。

發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸以乙酸為主，乙酸和丙酸濃度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，LOS及FOS 均可提高發(fā)酵液中的乙酸含量；除LOS3-1 外，LOS3-2，LOS4 以及FOS 對(duì)丙酸的產(chǎn)生均沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。發(fā)酵液中丁酸和異丁酸含量在6～12 h 內(nèi)快速上升，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，二者均不斷下降；3 種LOS 均可不同程度地增加丁酸轉(zhuǎn)化量。

乙酸、丙酸和丁酸是人和其它哺乳動(dòng)物腸道中豐度最高的3 種短直鏈脂肪酸，約占總短鏈脂肪酸的90%～95%，它們?cè)从谀c道菌群對(duì)非消化性碳水化合物的發(fā)酵作用。而異丁酸與異戊酸等短支鏈脂肪酸通常源于致腐微生物對(duì)蛋白質(zhì)的發(fā)酵作用。短直鏈脂肪酸具有塑造腸道環(huán)境、作為宿主細(xì)胞和腸道微生物的能量，以及參與不同的信號(hào)通路等特殊生理效應(yīng)，短鏈直鏈脂肪酸也因此被認(rèn)為是益生元發(fā)揮健康效應(yīng)的基礎(chǔ)。在龐大的腸道微生態(tài)系統(tǒng)中，不同微生物群體之間存在底物互生與代謝物互生現(xiàn)象[20]，基于這種現(xiàn)象，部分微生物可以在原本無(wú)法生長(zhǎng)的基質(zhì)中間接以底物降解物或代謝物作為碳源或能源。有報(bào)道指出[21-22]，雙歧桿菌發(fā)酵低聚果糖產(chǎn)生的乙酸可被羅氏菌、真桿菌等間接利用。發(fā)酵液中的丁酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降的原因可能是作為能源物質(zhì)被一些非丁酸產(chǎn)生菌所消耗導(dǎo)致。

圖3 蓮子低聚糖對(duì)發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸和異丁酸含量的影響Fig.3 Effect of LOS on acetic acid，propionic acid，butyric acid and isobutyric acid levels

2.4 發(fā)酵液NH3 含量變化

通過(guò)測(cè)定以蓮子低聚糖為碳源的腸道菌群發(fā)酵液中的NH3水平，比較不同蓮子低聚糖對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)酵作用影響的差異性，結(jié)果如圖4所示。在最初的12 h 內(nèi)，各組發(fā)酵液中的NH3含量均迅速增加；12 h 后，以Glc 為碳源的發(fā)酵液中的NH3持續(xù)緩慢增加，而添加蓮子低聚糖或低聚果糖的發(fā)酵液中NH3含量基本保持不變。NH3是一種潛在的有毒代謝產(chǎn)物，源于腸道微生物對(duì)蛋白質(zhì)的發(fā)酵作用。添加蓮子低聚糖可顯著降低發(fā)酵過(guò)程中NH3的產(chǎn)生，說(shuō)明蓮子低聚糖可抑制腸道微生物對(duì)培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的發(fā)酵作用，且不同碳源對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)酵的抑制作用依次為：LOS4>LOS3-2>LOS3-1>FOS>Glc。

2.5 益生指數(shù)

圖4 蓮子低聚糖對(duì)發(fā)酵液NH3 含量的影響Fig.4 The effect of LOS on ammonia level of broth

通過(guò)選擇性培養(yǎng)基定量測(cè)定發(fā)酵液中特定菌群的數(shù)量變化，結(jié)果如表2所示。體外發(fā)酵12 h后，4 種待測(cè)菌群的數(shù)量均迅速增加；與Glc 組相比，以LOS3-2 和LOS4 為碳源的發(fā)酵液中，雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量顯著增加 （P<0.05）；LOS4 和FOS 能顯著減少擬桿菌的數(shù)量，F(xiàn)OS 不容易被大腸桿菌所利用。發(fā)酵24 h 后，各組培養(yǎng)基的特定菌群數(shù)量呈此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)；與12 h 相比，各培養(yǎng)基的雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量基本呈下降趨勢(shì)；擬桿菌和大腸桿菌逐漸增加。以LOS3-2、LOS4 及FOS 為碳源的發(fā)酵液，雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量顯著高于Glc 組，而擬桿菌和大腸桿菌數(shù)量則顯著下降（P<0.05）。發(fā)酵過(guò)程中，各發(fā)酵液的細(xì)菌總數(shù)沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。

表2 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中小鼠腸道特定菌群數(shù)量的變化（lg CFU/mL，±s）Table 2 Effect of different carbon source on the number of special intestinal flora in mice （lg CFU/mL，±s）

表2 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中小鼠腸道特定菌群數(shù)量的變化（lg CFU/mL，±s）Table 2 Effect of different carbon source on the number of special intestinal flora in mice （lg CFU/mL，±s）

注：同列肩標(biāo)* 表示12 h 時(shí)與Glc 組相比差異顯著（P<0.05）；同列肩標(biāo)# 表示24 h 時(shí)與Glc 組相比差異顯著（P<0.05）。

?

益生指數(shù)是比較膳食益生元益生效果的量化指標(biāo)，本文以大腸桿菌代替原始公式中的梭狀芽胞桿菌[13]，通過(guò)測(cè)定小鼠腸道菌群發(fā)酵液中特定菌群及其與原始菌群數(shù)量的比例變化關(guān)系，以雙歧桿菌和乳桿菌為陽(yáng)性變化值（正值）；擬桿菌和大腸桿菌為陰性變化值（負(fù)值），獲得小鼠腸道菌群發(fā)酵不同碳源的益生指數(shù)，結(jié)果如圖5所示。

添加各碳源的培養(yǎng)基接種小鼠腸道菌群12 h 后，各發(fā)酵液的益生指數(shù)從高到低依次為：LOS4>LOS3-2>FOS>LOS3-1>Glc；其中LOS3-2、LOS4 的益生指數(shù)極顯著高于Glc 及LOS3-1 組（P<0.01）。而24 h 各組的益生指數(shù)則為：FOS>LOS3-2>LOS4>LOS3-1>Glc，與Glc 組 相 比，LOS3-2、LOS4 及FOS 組的益生指數(shù)同樣顯著提高（P<0.05），而3 種蓮子低聚糖之間沒(méi)有顯著性差異，且與12 h 相比，各組的益生指數(shù)均有不同程度下降。該結(jié)果與秦雪梅等[23]研究FOS、低聚半乳糖（GOS）以及聚葡萄糖（POL）對(duì)嬰兒腸道菌群的益生作用基本一致。有國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)，果膠與果膠低聚糖（POS）的益生指數(shù)與其甲基化程度及阿拉伯糖含量有關(guān)[24-25]，且分子質(zhì)量相對(duì)較小的POS 益生指數(shù)高于大分子質(zhì)量的果膠。由此推測(cè)，分子質(zhì)量相對(duì)較低的碳水化合物更適合作為腸道益生菌的發(fā)酵底物，從而表現(xiàn)出較高的益生指數(shù)。

圖5 小鼠腸道菌群發(fā)酵蓮子低聚糖12，24 h 的益生指數(shù)Fig.5 The prebiotic index from mouse intestinal flora fermentation of LOS at time 12 h and 24 h

3 結(jié)論

本文以3 種不同結(jié)構(gòu)的蓮子低聚糖單體為碳源，通過(guò)腸道菌群體外發(fā)酵試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其體外益生效果及其差異，結(jié)果表明：蓮子低聚糖體外益生效果良好，不同結(jié)構(gòu)蓮子低聚糖的體外益生效果表現(xiàn)出一定的差異性：

1） 3 種低聚糖均可增加發(fā)酵液中的乙酸和丁酸含量，顯著抑制腸道微生物對(duì)蛋白質(zhì)的發(fā)酵作用，減少NH3的生成，對(duì)碳水化合物/蛋白質(zhì)發(fā)酵平衡產(chǎn)生有利影響。

2） LOS3-2 及LOS4 表現(xiàn)出比LOS3-1 更好的益生效果，二者均可顯著提高12 h 發(fā)酵液中的雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量，同時(shí)降低24 h 的擬桿菌和大腸桿菌數(shù)量。

3） 各碳源的益生指數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，以LOS3-2 及LOS4 為碳源的益生指數(shù)在12 h 極顯著高于Glc 及LOS3-1 組 （P<0.01）；LOS3-2 與LOS4 的益生指數(shù)在24 h 仍然顯著高于Glc 組，3 種蓮子低聚之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。