劉迪迪 邱軍強 張 華 魏增衍 王振宇*

（1 哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院 食品科學與工程系 哈爾濱150090 2 黑龍江省農業(yè)科學院 食品加工研究所 哈爾濱150086 3 海南醫(yī)學院 藥學院 無機化學與分析化學教研室 海口570100）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種由遺傳因素、自由基、免疫功能紊亂、微生物感染及毒素、精神因素等多種致病因子作用于機體，導致胰島功能減退，胰島素抵抗，而引發(fā)的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂的綜合癥，是一種以高血糖為特征的代謝性疾病[1-3]。糖尿病大致可分為兩種：胰島素依賴型（I 型）、非胰島素依賴型（II 型），后者是最常見的糖尿病類型，占所有糖尿病疾病的90%～95%，會導致嚴重的健康及經濟問題[4]。

世界成人糖尿病人數(shù)為3.47 億，而至2030年這個數(shù)字可能會翻一番還多。2012年，糖尿病是造成150 萬人死亡的直接原因[5-6]。迄今為止，都未能找到根治糖尿病的方法，然而可以通過控制飲食，輔以運動或藥物等控制血糖升高，防治并發(fā)癥。目前，臨床治療糖尿病常用合成口服降糖藥物，長期服用均有一定的不良反應及毒副作用[7-8]，如低血糖，臟器損傷。近年來很多研究學者致力于從植物資源中尋求治療糖尿病的藥物[9]。

紅松（Pinus koraiensis Sieb.Et Zucc）主產于我國黑龍江省東北部長白山、小興安嶺等山林地區(qū)，紅松松仁營養(yǎng)豐富，食療價值較高，《本草綱目》記載：“松仁性溫、味甘、無毒、主治關節(jié)風濕、頭眩、潤五臟、逐風痹寒氣、補體虛、滋潤皮膚、久服輕身不老”。有研究表明松仁具有多種免疫藥理活性，對造血系統(tǒng)有明顯作用，對抗腫瘤，抗輻射損傷也顯示較好的效果，且具有軟化血管，降低血脂、膽固醇、甘油三酯，增強耐力，抗疲勞的療效，還具有抗氧化，延緩衰老等功能[10-14]，具有廣闊的應用開發(fā)潛力，然而，對于降血糖功能還未有報道。本研究選取松仁脫脂粉為研究對象，以其稀堿提取物灌胃高糖高脂飲食，結合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠，考察其降血糖功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松松仁，伊春紅松樹林成熟球果。

鏈脲佐菌素（STZ），中國Biosharp 公司；血清胰島素，北京索萊寶科技有限公司；鹽酸二甲雙胍片，上海北杰集團關東藥業(yè)有限公司；生理鹽水，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司；石油醚，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；檸檬酸鈉、檸檬酸、氫氧化鈉均為國產分析純級，天津光復化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

電子天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；勻漿機（FA-25 型），上海弗魯克流體機械制造有限公司；數(shù)控超聲波儀（KQ-500DE 型），昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀（R-1005 型），鄭州長城科工貿有限公司；離心機（H2050R 型），長沙湘儀離心機儀器有限公司；全波長酶標儀，美國Thermo Electron 公司；血糖儀（GA-3 型），三諾生物傳感股份有限公司。

1.3 實驗動物

清潔級昆明小鼠100 只6～8 周齡，雄性，體質量（32.8±2.35）g，哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，實驗動物許可證號：SCXK（黑）2013-001。

基礎鼠糧、高糖高脂鼠糧，青島大任富城畜牧有限公司。高糖高脂鼠糧配方[15-16]：基礎鼠糧54%、豬油20%、糖15%、蛋黃粉10%、膽固醇0.5%、膽酸鈉0.5%。

1.4 試驗方法

1.4.1 松仁稀堿提取物的制備[12]

原料預處理：將松仁粉碎后，采用石油醚脫脂、干燥，再次粉碎，過篩待用。

松仁稀堿提取物提?。簻蚀_稱取按上述處理得到的脫脂松仁干粉60 g 加入0.01 mol/L NaOH溶液中浸提，料液比1∶45，提取溫度40 ℃，超聲提取時間35 min。提取液在3 000 r/min 條件下離心10 min，除去殘渣，殘渣再用蒸餾水提?。ㄖ貜?次）；合并上清液，將溶液pH 值調為7.0 后進行減壓濃縮，得到濃縮液，以苯酚硫酸法測定其多糖含量，分別稀釋為低、中、高3 種設計濃度。1.4.2 糖尿病小鼠模型建立[17-18]小鼠飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，空氣濕度適宜，12 h 明暗交替。先以基礎鼠糧適應性喂養(yǎng)7 d，再隨機分為2 組，第1 組10 只為正常對照組（NC），第2 組90 只為造模組。以基礎鼠糧飼養(yǎng)第1 組，以高糖高脂鼠糧飼養(yǎng)第2 組。飼養(yǎng)5 周后，從第2 組中取出10 只作為高糖高脂對照組 （HC），其余小鼠禁食不禁水處理12～16 h，分別以檸檬酸-檸檬酸鈉溶液緩沖液及檸檬酸-檸檬酸鈉溶液緩沖液配制的1%STZ 進行腹腔注射，每次劑量為100 mg/kg，造2 型糖尿病小鼠模型，72 h 后禁食10 h 剪尾取血，以血糖儀測定小鼠空腹血糖值，對低于11.1 mmol/L 的小鼠進行小劑量補注射，72 h 后再測，以2 次均高于11.1 mmol/L 為造模成功。造模時間為1 周。

1.4.3 試驗動物分組及處理 取造模成功的小鼠50 只，隨機分為5 組，每組10 只，分別設為糖尿病模型組（DM）灌胃生理鹽水、鹽酸二甲雙胍陽性藥物組（PC）（166 mg/kg bw·d）、紅松仁稀堿提物低、中、高劑量組（KPS-AE-L，KPS-AE-M，KPSAE-H）（分別為125，250，500 mg/kg bw·d），以上各組飼喂高糖高脂鼠糧。正常對照組（NC）、高糖高脂對照組（HC）均灌胃生理鹽水，每天將受試樣品按劑量給小鼠灌胃1 次，每次0.4 mL/只，自由進食和飲水，連續(xù)14 d。每天記錄小鼠進食量及飲水量，每周稱量小鼠體質量，觀察小鼠狀態(tài)。

1.4.4 攝食量及飲水量測定 每天分別定時按組投放定量的鼠糧和飲用水，次日記錄剩余鼠糧質量和飲用水體積，公式為：

式中，m1——每天投放的鼠糧質量，g；V1——每天投放的飲用水體積，mL；m2——次日剩余的鼠糧質量，g；V2——次日剩余的飲用水體積，mL。1.4.5 空腹血糖（FBG）的測定[19]小鼠禁食不禁水12 h，采用剪尾采血法取小鼠尾尖血一滴，使用血糖儀及血糖試紙對小鼠進行血糖測定，重復2 次。本試驗中，分別在灌胃受試藥物的第0，7，14天測定空腹血糖值。

式中，F(xiàn)BG0——給藥前空腹血糖值，mmol/L；FBG2——給藥2 周結束后空腹血糖值，mmol/L。1.4.6 口服葡萄糖耐量（OGTT）測定[20-22]在小鼠末次給藥前一天，禁食4 h，經口給予2.0 g/kg 葡萄糖溶液，于0，30，60，120 min 測定血糖值并記錄，并根據公式計算各時間點血糖曲線下面積（AUC）：

式中，a，b，c，d——灌胃葡萄糖溶液0，30，60，120 min 后的血糖值，mmol/L。

1.4.7 試驗后動物處理 試驗周期為8 周，末次給藥后禁食，宰殺當日稱量體質量、空腹血糖值并記錄，眼球取血法取全血，室溫靜置30 min，4 ℃冷藏靜置3 h，離心分離血清，-80 ℃冷凍備用。

1.4.8 血清胰島素測定[23-24]按試劑盒說明測定血清胰島素含量并計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）及胰島素分泌指數(shù)（FBCI）。

1.5 數(shù)據統(tǒng)計與分析

運用SPSS13.0 軟件進行單因素方差分析（One Way ANOVA）與顯著性檢驗，數(shù)據以平均數(shù)±標準差（±s）表示，P<0.05 則有顯著性差異，有統(tǒng)計學意義，P<0.01 為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 松仁稀堿提取物對小鼠體質量的影響

建模前小鼠體質量為（32.8±2.35）g，基礎鼠糧及高糖高脂鼠糧飼養(yǎng)的小鼠體質量均穩(wěn)定增長，前兩周高糖高脂組小鼠體質量升高最快，之后增長放緩，與普通鼠糧喂養(yǎng)組相比體質量差逐漸縮小，以致第5 周時體質量增加至約45 g 后，體質量處于較穩(wěn)定狀態(tài)，兩組體質量相近，如圖1a 所示。這可能與長期高脂喂養(yǎng)，影響小鼠食欲，攝食量有所減少有關，且小鼠體質量接近上限，增長也會放緩。另外，改變飲食初期，身體正常代謝水平還沒有立即遭到破壞，在一段時間內仍然可以在一定程度上自行調節(jié)。然而，從體型上看高糖高脂喂養(yǎng)組體型略微顯胖，體脂偏多，普通鼠糧喂養(yǎng)組體型勻稱。從精神狀態(tài)看，兩組鼠均健康活躍，毛發(fā)順滑。

各組小鼠給藥期間體質量如圖1b 所示，繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)的HC 組小鼠比普通鼠糧喂養(yǎng)的NC 組體質量差逐漸增大，在臨宰殺前需要禁食，所以體質量下降，HC 組較NC 組下降更多，說明高脂鼠在饑餓時消耗更多脂肪來轉化為能量。其它各組均為高糖高脂飼料喂養(yǎng)的糖尿病鼠，造模期間，非糖尿病鼠體質量仍在增長，注射STZ組小鼠體質量有所下降，開始治療后陽性對照PC組對體質量穩(wěn)定相對最好，其次為KPS-AE-H組，其它各組均比陰性對照DM 組好。

因此，高糖高脂飲食對糖脂代謝的紊亂在飲食改變初期雖未必體現(xiàn)，但長此以往將埋下隱患。各治療組對糖尿病鼠的體質量控制有一定的改善作用，尤其后期，DM 組體質量下降更為明顯，而治療組則相對平穩(wěn)。除PC 組外，KPS-AE-H 組表現(xiàn)更佳。另外，糖尿病模型小鼠一直飼喂高糖高脂飼料，KPS-AE 可能具有幫助減少多余脂肪的作用，這也會使體質量下降[25]。

圖1 造模前、后小鼠體質量變化（±s，n=10）Fig.1 Body weight change of mice before and after modeling （±s，n=10）

2.2 松仁稀堿提取物對小鼠進食量和飲水量的影響

STZ 造模成功后，糖尿病小鼠均出現(xiàn)“三多一少”的典型癥狀，即飲水、進食、排尿量增多，體質量下降。如圖2所示為試驗期間每只小鼠每天的進食量與飲水量均值。DM 組、KPS-AE-L 組和KPS-AE-M 組進食量顯著高于NC 組，而PC 組、KPS-AE-H 組與NC 組差異不顯著，KPS-AE 治療組在進食量方面普遍沒有PC 組控制的理想。在飲水量方面，糖尿病患病組顯著高于正常組，DM 組每只小鼠每天飲水約20 mL，而正常小鼠約為6 mL，前者為后者的3 倍還多。經二甲雙胍及KPSAE 治療，“三多一少”癥狀有所緩解，PC 組、KPSAE-M 組均顯著低于DM 組，KPS-AE-M 組（13.03 mL/d）比DM 組（19.81 mL/d）降低了34%。

2.3 松仁稀堿提取物對小鼠空腹血糖的影響

血糖平衡取決于葡萄糖利用和肝臟葡萄糖輸出之間的平衡，這是通過胰島素敏感組織（肝臟、脂肪組織、骨骼肌）及不敏感組織調節(jié)的[4]。葡萄糖濃度通常在一個狹窄范圍內波動，葡萄糖利用功能障礙，包括葡萄糖攝取、磷酸化，糖原的儲存以及肝葡萄糖輸出異常損害葡萄糖穩(wěn)態(tài)，可能導致2 型糖尿病[26]。造模成功后小鼠空腹血糖值顯著高于正常值，經過2 周灌胃KPS-AE，小鼠空腹血糖值均有所下降，明顯低于高血糖模型組，結果見表1。

圖2 對小鼠進食量和飲水量的影響Fig.2 Effect of food and water intake in mice

由表1可見，NC 組空腹血糖值始終正常且穩(wěn)定，HC 組因攝食高糖高脂鼠糧空腹血糖值比NC組偏高，且稍有波動。灌胃前，DM 組及各治療組血糖值差異不顯著，然而極顯著高于NC 及HC 對照組。灌胃1 周后，DM 組及各治療組血糖呈上升趨勢，可能由于以STZ 建立糖尿病模型，會選擇性破壞小鼠胰島β 細胞，使機體內胰島素分泌不足，使血糖值持續(xù)穩(wěn)定升高[27]，而各治療組與DM組相比上升明顯受到抑制。灌胃2 周后，DM 組空腹血糖值高達23.95 mmol/L，約為NC、HC 組的3倍，2 周后DM 組血糖升高了51.68%，而治療組血糖值極顯著低于DM 組，PC 組能抑制血糖的繼續(xù)升高，灌胃2 周后血糖值基本控制在治療前水平，KPS-AE 各劑量組降低空腹血糖的效果比PC 組優(yōu)勢更明顯，其中KPS-AE-M 組效果最顯著，降糖率達25.47%。

表1 小鼠空腹血糖值（±s，n=10）Table 1 Fasting blood glucose （FBG） of mice （±s，n=10）

表1 小鼠空腹血糖值（±s，n=10）Table 1 Fasting blood glucose （FBG） of mice （±s，n=10）

注：* 與NC 組相比差異顯著（P＜0.05）；** 與NC 組相比差異極顯著（P＜0.01）；#與DM 組相比差異顯著（P＜0.05）；##與DM 組相比差異極顯著（P＜0.01）；^ 與PC 組相比差異顯著（P＜0.05）；^^ 與PC 組相比差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別空腹血糖值/mmol·L-1灌胃前（FBG0） 灌胃1 周（FBG1） 灌胃2 周（FBG2）降糖率/%NC 7.15±0.90##^^ 7.45±0.89##^^ 7.06±1.78##^^ -HC 11.34±2.44*#^ 8.76±1.33##^^ 8.64±1.61##^^ -DM 15.79±5.95** 22.63±5.03** 23.95±4.95**^^ -51.68 PC 14.18±4.47** 19.74±4.30** 15.56±4.69**## -KPS-AE-L 13.90±2.86** 21.93±4.28** 12.08±5.33*## 13.09 KPS-AE-M 13.27±3.78** 16.30±5.36**# 9.89±3.09##^^ 25.47 KPS-AE-H 14.72±3.47** 23.70±5.69** 12.72±5.68**## 13.59

2.4 松仁稀堿提取物對小鼠口服葡萄糖耐受量的影響

口服葡萄糖耐量試驗是一種葡萄糖負荷試驗，用以了解胰島β 細胞功能和機體對血糖的調節(jié)能力。正常情況下，進食糖類后血糖會暫時升高，0.5～1 h 后升到最高峰，2 h 后回到空腹水平?；加刑悄虿』蛱悄土慨惓Ｕ邉t不遵循此規(guī)律，出現(xiàn)血糖值升高及節(jié)律紊亂。OGTT 試驗是診斷早期糖尿病和代謝性疾病的常用而有效的方法[28]。給藥2 周結束，進行小鼠口服葡萄糖耐受量的測試，分別以0，30，60，120 min 的血糖值曲線及曲線下面積（AUC）來表示，結果見圖3。

圖3 小鼠口服葡萄糖耐量結果（±s，n=10）Fig.3 Results of oral glucose tolerance test of mice （±s，n=10）

圖3a中空白組NC 在口服葡萄糖30 min 后血糖由7 升高至12.5 左右，在60 min 時接近口服前血糖水平，2 h 后恢復正常。而HC 組上升和下降均更緩慢，表現(xiàn)不及NC 組敏感。DM 組血糖最高，且在前1 h 一直在升高，之后呈緩慢下降。

圖3b中可見糖尿病患病組AUC 面積均顯著增加，KPS-AE-L 及KPS-AE-M 組與DM 組相比改善作用明顯，而KPS-AE-H 組對葡萄糖耐受量改善情況不理想。在空腹血糖測試中灌胃KPSAE 的各組也有在第1 周血糖上升而第2 周緩解的現(xiàn)象，分析這可能與在灌胃KPS-AE 期間雖然利用葡萄糖的能力稍有改善，但還需要更長時間的治療，2 周內每天灌胃多糖量偏大可能會引起血糖或葡萄糖耐量曲線下面積暫時性的升高，所以灌胃低中劑量已表現(xiàn)出葡萄糖耐受量的改善，而繼續(xù)治療一定周期，功能改善增強，可能會有不一樣的效果，此推論還有待進一步證實。

2.5 松仁稀堿提取物對小鼠血清胰島素的影響

血清胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素[29]。KPS-AE 對小鼠血清胰島素的影響見表2。

胰島素敏感指數(shù)（ISI）是臨床檢查胰島素分泌的指標，用來評價胰島素抵抗的程度，ISI 預測血漿葡萄糖濃度最初的升高，主要取決于肝臟胰島素抵抗和內源性葡萄糖生成抑制，對葡萄糖誘導胰島素釋放做出反應[21]。

如表2所示，DM 組血清胰島素濃度顯著高于對照組，而其它各組與對照組相比則差異不顯著。各治療組與DM 組相比，胰島素濃度均降低，PC及KPS-AE-L 組下降不明顯，而KPS-AE-M 組及KPS-AE-H 組則分別呈顯著降低及極顯著降低結果。KPS-AE 各劑量組比PC 組更接近NC 組的血清胰島素濃度，其中KPS-AE-H 組與PC 組相比效果最明顯。由此說明KPS-AE 能夠有效提高胰島素分泌量。

表2中各患病組除KPS-AE-M 組外其它各組的胰島素敏感指數(shù) （ISI） 均比NC、HC 對照組低，且差異極顯著，其中DM 組最低，與NC 組相比降低超過50%，KPS-AE 各劑量組效果好于PC組，可見KPS-AE 能夠增強胰島素敏感性，其中KPS-AE-M 效果最佳。

表2 KPS-AE 對小鼠血清胰島素的影響Table 2 Effect of KPS-AE on serum insulin in mice

與對照組相比各患病組胰島素分泌指數(shù)顯著下降，DM 組分泌指數(shù)最低，僅為NC 組的31%，各治療組中，KPS-AE 各劑量組結果均高于PC 組，其中KPS-AE-M 組降低幅度最小，說明KPS-AEM 組胰島素分泌量最接近對照組，可能具有抑制胰島細胞凋亡，恢復胰腺損傷，保護胰島β 細胞，促進胰島素的分泌，從而幫助穩(wěn)定血糖水平，減小血糖波動范圍，發(fā)揮對高血糖的輔助調節(jié)作用[30]。

3 討論

在生物活性成分降血糖研究中，STZ 誘導的糖尿病大鼠模型最為常用。通過少量多次腹腔注射STZ 容易誘導產生2 型糖尿病。STZ 可在大鼠體內產生過量自由基使β 細胞功能受損，胰島素合成減少，從而引發(fā)糖尿病[31]。使用胰島素和口服降血糖藥物治療糖尿病雖然效果直接，但是臨床應用中往往伴隨低血糖，肝臟受損等副作用。與其它研究中陰性對照組小鼠狀態(tài)類似[32]，DM 組小鼠皮毛暗淡無光，身體瘦弱，動作遲緩，飲水量、攝食量和排尿量均增加。在本研究中采用二甲雙胍作為陽性對照藥品，能夠緩解糖尿病小鼠多飲、多食，肌體消瘦的狀況，綜合來看沒有KPS-AE-M組效果更為理想。推測與紅松松仁富含蛋白質、多糖及多種維生素和礦物質在小鼠體內發(fā)揮生物活性有關。已有研究報道表明，植物來源生物活性蛋白肽，如被稱為植物胰島素的苦瓜多肽及人參多肽、靈芝多肽[33]，還有多糖類，如南瓜多糖、食用菌多糖等均有較好的降血糖效果[34-35]，且某些堿提酸性多糖在特定生物功能方面優(yōu)于酸提及水提多糖[36]。另有研究表明松仁具有降血脂，增強免疫力的功效，也可以起到調節(jié)糖脂代謝，輔助治療糖尿病的作用[10，12]。

空腹血糖往往被認為是診斷糖尿病的常規(guī)指標，與口服葡萄糖耐受量試驗及血清胰島素、胰島素敏感指數(shù)相結合可反映機體對血糖的調節(jié)能力，胰島β 細胞功能和對胰島素的敏感性。本試驗中用藥一周還不足以發(fā)揮治療作用，所以血糖出現(xiàn)暫時性波動，在治療2 周后表現(xiàn)出降低血糖，改善口服葡萄糖耐量及血清胰島素的功效。一些研究表明糖尿病鼠胰島功能受損，胰島素分泌能力會下降，在本試驗中雖然糖尿病小鼠DM 組血清胰島素比正常組還稍高，但胰島素敏感指數(shù)及分泌指數(shù)還是偏低，即并不足以分泌足量胰島素以調整糖尿病鼠的高血糖狀況，表明其胰島素分泌相對不足。也有研究表明，苦瓜、大豆都可以作為促胰島素分泌的食物，而亞麻籽、黃葵種子、蕎麥粉、甘薯可以增加胰島素敏感性[37-41]。

綜上所述，本試驗對紅松松仁稀堿提取物的降血糖功能進行了體內驗證，結果表明紅松松仁稀堿提取物對糖尿病小鼠患病期間體質量下降，多飲、多食癥狀有一定的控制作用，可以明顯降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，改善小鼠口服葡萄糖耐受量，可以保護恢復胰腺功能，提高小鼠胰島素分泌能力及敏感指數(shù)。表明紅松松仁稀堿提取物有開發(fā)成為抗糖尿病功能性產品的潛力，其具體作用機理還有待深入研究。