李奕豐 郭曉英

1.中國醫(yī)科大學(xué)臨床一系, 遼寧 沈陽 110122 2.中國醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院，遼寧 沈陽 110122

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種已知的內(nèi)分泌干擾物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)，廣泛存在于環(huán)境和日常用品中，如食物、飲料的碳酸聚酯包裝材料、金屬罐頭的樹脂內(nèi)膜及其他產(chǎn)品的添加劑等。據(jù)報道一般人群血清中BPA濃度約為0.1～10 μmol/ L[1]。BPA與雌激素結(jié)構(gòu)相似，能通過競爭結(jié)合雌激素受體調(diào)節(jié)或破壞內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響神經(jīng)、生殖、免疫系統(tǒng)和代謝，與前列腺癌和乳腺癌、肥胖、骨質(zhì)疏松等疾病密切相關(guān)[2]。

骨是一種對激素敏感的器官，骨骼的發(fā)育和重建受激素的精細(xì)調(diào)控。BPA通過與雌激素受體(estrogen receptor，ERs)和雄激素受體(androgen receptor，AR)結(jié)合，干擾內(nèi)源性激素的穩(wěn)態(tài)，抑制破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低血漿鈣水平，進(jìn)而造成骨骼幾何形態(tài)、強(qiáng)度等方面的改變，甚至因骨代謝失常造成全身疾病[3]。本文就BPA對骨分化和骨密度影響及其機(jī)制作以綜述。

1 雙酚A暴露對骨分化及骨密度的影響

1.1骨分化。

骨骼的形成包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。膜內(nèi)成骨為間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鈣化后直接成骨，多見于扁平骨，如顱蓋骨及面骨。軀干骨及四肢骨則是以軟骨內(nèi)成骨方式形成，先形成軟骨雛形，隨之軟骨逐漸被替換，形成骨組織。BPA對膜內(nèi)成骨的影響尚未見報道。目前BPA對軟骨內(nèi)成骨的研究多集中在對股骨、椎體等的影響。骨重建的過程由成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞兩者的動態(tài)平衡實(shí)現(xiàn)，受雌激素的影響。因?yàn)椴煌驱g、類型的骨骼中成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的ERs各亞型的數(shù)量和比例不同，而BPA對各ERs亞型有不同的親和力。因此，特定的細(xì)胞類型和暴露的時間可能引起B(yǎng)PA對骨細(xì)胞的獨(dú)特反應(yīng)，表現(xiàn)出高度的發(fā)育階段相關(guān)性及性別相關(guān)性[4]，且不同實(shí)驗(yàn)條件(劑量、染毒時間、實(shí)驗(yàn)對象)產(chǎn)生的效應(yīng)不同。

以往的研究認(rèn)為毒性水平的BPA以劑量依賴性方式(0.5～12.5 μmol/L)在體外有效抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和活性，刺激兩種細(xì)胞的凋亡[2]。不同學(xué)者對不同發(fā)育階段的不同性別和品系鼠、采用不同劑量進(jìn)行了BPA對股骨及椎體影響的研究。

Katherine等以10 μg/(kg.d) BPA灌胃C57BL/6 J小鼠，從妊娠第11天到產(chǎn)后第12天，結(jié)果顯示BPA增加股骨長度且在雄性中更具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增強(qiáng)雄性而減弱雌性股骨抗扭承載力[4]。這種股骨長度增加和拉伸減少的綜合效應(yīng)導(dǎo)致扭轉(zhuǎn)極限減小，這些結(jié)果提示了發(fā)育暴露于環(huán)境相關(guān)水平的PBA對骨分化的負(fù)面作用。由同一小組的兩項(xiàng)不同研究，則提示了不同劑量BPA對不同性別大鼠后代的骨分化的不同影響：對Wistar大鼠孕哺期染毒[0、25、250、5 000μg和50 000μg BPA/(kg.d) ]的結(jié)果為25和5 000μg的雌性后代股骨伸長分別為1.8%和2.1%，暴露于25μg BPA的雄性后代股骨干骨皮質(zhì)顯著較厚(4.7%)[3]；更低劑量的研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠3.5 d直到出生后第22天分別用0.5和50μg BPA/(kgBW.d)感染Fischer 344大鼠，5周齡時處死子代，結(jié)果提示雄性子代股骨分別變短2.2%和1.8%，降低了雄性子代總礦物質(zhì)含量、總橫截面積、小梁面積、骨膜周長以及骨內(nèi)膜周長，而對雌性無明顯作用[5]。此外，Auxietre等[6]在妊娠和哺乳期間口服給予雌性Wistar大鼠BPA，在出生后第30、110天(d30，d110)研究F1和F2后代的骨骼異常。對椎骨的研究數(shù)據(jù)顯示F1雌性橫突間寬度增加，椎骨變短，生長板厚度特別是肥大區(qū)厚度減少，而對F1雄性及所有F2個體無明顯影響，這種效應(yīng)在雌性F1大鼠出生30 d達(dá)到最大并于110 d消失。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有多種分化潛能，可以分化為脂肪、骨及肌肉組織，BPA促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化，抑制骨分化[1]。但近期在人間質(zhì)干細(xì)胞分化研究中的結(jié)果則表明：非毒性低濃度(1和10 nmol/L)的BPA會刺激成骨，但沒有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且僅出現(xiàn)于間質(zhì)干細(xì)胞分化前預(yù)處理的情況下[7]。

1.2 骨密度。

盡管在前述實(shí)驗(yàn)條件下觀察BPA對骨密度無明顯影響[3,5]，更多研究證實(shí)BPA暴露可降低骨密度。Zhang等[8]給4 周齡雌性 F344 大鼠灌胃給藥50、200、400 mg /(kg.d)，13周后測定椎體及股骨骨密度，結(jié)果顯示200 mg BPA/(kg BW.d)組椎體骨密度最低，50 mg BPA/(kg BW.d)組股骨骨密度最低，提示BPA降低骨密度，而苯甲酸雌二醇EB增加椎體骨密度增高，證實(shí)雌激素可減少骨流失。

如前所述BPA刺激間質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化而抑制其骨分化，而有學(xué)者在絕經(jīng)前女性群體中證實(shí)BPA增加脂肪，但并未出現(xiàn)明顯的骨密度改變，說明BPA對骨密度的影響可能與脂肪代謝無關(guān)[9]。

盡管由于暴露劑量及實(shí)驗(yàn)對象的種屬差異等因素，研究結(jié)論不甚一致，但基本的共識是環(huán)境劑量暴露BPA 負(fù)向影響成骨分化和骨密度，引起骨質(zhì)減少、微結(jié)構(gòu)惡化、增加骨脆性，誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥。不同時期BPA暴露會產(chǎn)生不同的效應(yīng)，生命早期暴露于EDCs可產(chǎn)生不可逆的損害，并造成一些成人時期疾病。相反，成人接觸EDCs的影響往往是可逆的，但鑒于BPA存在的廣泛性和強(qiáng)脂溶性，其對于成年個體骨質(zhì)的損害也不容忽視。

2 雙酚A影響骨代謝的作用機(jī)制

2.1BPA的抗雌激素效應(yīng)及雌激素效應(yīng)

BPA與雌激素(estrogen，E2)沒有結(jié)構(gòu)同源性，但通常作為異雌激素并選擇性調(diào)節(jié)ERs。研究表明，雖然BPA對ERs的親和力較低，但它的影響強(qiáng)于E2，尤其是對非經(jīng)典途徑的作用，如G蛋白偶聯(lián)受體(GPER)和雌激素相關(guān)受體(ERR)。BPA通常表現(xiàn)出雌激素拮抗效應(yīng)，少數(shù)情況會顯示雌激素效應(yīng)，取決于ER亞型和所涉及的組織[2]。

E2有維持骨骼的功能，如抑制促破骨細(xì)胞形成配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)表達(dá)，抑制白細(xì)胞介素(IL-1、6和11)、前列腺素(PGE-2)、TNF-α、TGF-β和胰島素樣生長因子(IGF)系統(tǒng)，通過減弱破骨細(xì)胞活性或直接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能來減少骨吸收。E2促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，并維持鈣穩(wěn)態(tài)，保證血漿鈣水平。BPA通過結(jié)合雌激素相關(guān)受體-γ(ERγ)產(chǎn)生雌激素拮抗作用，增加RANKL的表達(dá)，提高破骨細(xì)胞的活性，抑制成骨細(xì)胞分化，降低血漿鈣水平[10]。

區(qū)別于ERγ，BPA結(jié)合ERα造成雌激素效應(yīng)，如BPA改變蛋白激酶C的亞型，加速哺乳動物軟骨的老化和骨骺閉合。Auxietre等[6]研究BPA對椎骨橫突的形態(tài)改變，發(fā)現(xiàn)孕哺乳期染毒使雌性個體到椎體生長板特別是肥大區(qū)的縮小，這種效應(yīng)在出生后30 d達(dá)到最大，提示骨骼的早熟，該現(xiàn)象為雌激素效應(yīng)。研究者通過加入雌激素受體的抑制劑和激動劑，證實(shí)了上述改變?yōu)锽PA的雌激素效應(yīng)導(dǎo)致。

2.2BPA對雄激素受體(AR)的作用

雄激素受體在骨發(fā)育和骨轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要的作用，能增加培養(yǎng)中骨細(xì)胞的ALP陽性細(xì)胞的數(shù)量和陽性強(qiáng)度，促進(jìn)骨細(xì)胞分化。在對大鼠的研究中，雌激素對雌性骨骼發(fā)育的作用更加明顯，使股骨更短更薄。而BPA對雄性骨骼的影響更顯著，這表明BPA暴露的影響可能不僅僅是雌激素受體相關(guān)效應(yīng)[5]。有基因測定報告證明，BPA是AR拮抗劑，通過多種機(jī)制作用于雄激素受體。

2.3BPA調(diào)控凋亡相關(guān)因子

在各種病理及生理狀態(tài)下凋亡參與調(diào)控骨組織的發(fā)育、生長和穩(wěn)態(tài)。前期研究證實(shí)BPA調(diào)控凋亡相關(guān)通路，促進(jìn)凋亡。BPA調(diào)控Bcl-2家族Bad元件，從而影響凋亡效應(yīng)因子Caspase8、9和3的激活。同時，BPA影響調(diào)控凋亡的NFATc1、MAPK、ERK和AKT等重要信號通路。體內(nèi)體外研究均證實(shí)BPA還通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激來刺激凋亡，總尿BPA水平與氧化應(yīng)激水平呈高度正相關(guān)[2,10-11]。

2.4BPA參與DNA表觀修飾

位于細(xì)胞核的雌、雄激素受體分別與相應(yīng)激素結(jié)合后激活，配體-受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA特定基因，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，這種效應(yīng)不會遺傳給子代。早期研究認(rèn)為，BPA孕哺期染毒對軟骨內(nèi)成骨的影響不能夠遺傳，然而Jacques等[12]的研究中，BPA使雄性大鼠足趾比例雌性化可以遺傳給子代，猜測與DNA表觀修飾有關(guān)。表觀遺傳機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾(乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等)以及microRNAs在內(nèi)的非編碼RNA的表達(dá)。BPA暴露可以誘導(dǎo)持久的表觀遺傳破壞，BPA很可能通過CpG位點(diǎn)的甲基化作用影響表觀遺傳機(jī)制，并誘導(dǎo)了組蛋白修飾，改變了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄活性。雙酚A促進(jìn)小鼠乳腺中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)蛋白的翻譯，通常會增加H3K27me3而導(dǎo)致基因抑制[13]。

然而表觀遺傳不表現(xiàn)在對股骨長度的影響上。近期Xin等[14]研究了BPA對骨的作用有無母系傳代效應(yīng)，綜合Auxietre等[6]對父系傳代效應(yīng)的研究，BPA造成的影響在實(shí)驗(yàn)條件下不能證明影響F2股骨形態(tài)和強(qiáng)度。

2.5BPA參與Wnt /β-catenin信號對骨代謝的調(diào)控

Wnt/β-catenin信號是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的經(jīng)典通路，BPA通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響干細(xì)胞增殖分化的學(xué)說被廣泛認(rèn)同。在骨分化的調(diào)控中，BPA抑制Wnt/β-catenin信號通路從而干擾骨骼代謝。一項(xiàng)應(yīng)用斑馬魚的研究表明BPA暴露上調(diào)凋亡是由于Wnt3a 誘導(dǎo)的促凋亡改變。Wnt /β-catenin信號既受到活性氧簇的調(diào)節(jié)(即受氧化應(yīng)激條件的干擾)，又參與由ROS改變細(xì)胞存活程序造成的細(xì)胞死亡；Wnt/β-catenin能抑制RANKL的表達(dá)和上調(diào)成骨細(xì)胞分泌的骨保護(hù)素(osteoprotegrin，OPG)的表達(dá)，OPG能結(jié)合RANKL而抑制破骨細(xì)胞的活化[10,15]?？梢夿PA干擾骨骼的多種信號通路之間、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間相互聯(lián)系與制約。

3 小結(jié)

BPA復(fù)雜的分子使其影響具有雙重性，例如BPA一方面提高破骨細(xì)胞的活性，另一方面通過凋亡相關(guān)蛋白和氧化應(yīng)激途徑引起成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞凋亡。因此，BPA對不同物種、相同物種不同發(fā)育階段的影響差異很大。不同品系、劑量、染毒方式干擾對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，以往實(shí)驗(yàn)結(jié)論停留在與上述因素相關(guān)，具體影響的方式還需更加系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)。目前BPA對骨骼機(jī)制的研究多為推測，尚不能確定。因此，為了解BPA對人類骨骼發(fā)育的干擾和損傷效果，有必要進(jìn)行關(guān)于BPA對特定組織特定發(fā)育階段的作用機(jī)制的研究。