劉玉美 李婷 楊秀疆

胰腺癌惡性程度高、發(fā)現(xiàn)晚，晚期常伴有高發(fā)的肝轉(zhuǎn)移而預(yù)后不佳，目前在西方國(guó)家腫瘤相關(guān)死亡中居第4位［1］。為研究胰腺癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機(jī)制、驗(yàn)證新型化療方案的可行性和有效性，需要進(jìn)行大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究或臨床試驗(yàn)。其中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用相關(guān)動(dòng)物模型模擬人類腫瘤環(huán)境，從而進(jìn)行腫瘤相關(guān)研究。建立適宜的胰腺癌動(dòng)物模型，可以為深入研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制以及尋找新的治療策略提供有效的手段。小體積的脾內(nèi)和胰腺內(nèi)注射法是自發(fā)肝轉(zhuǎn)移模型的理想選擇，用于研究調(diào)控胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制。胰腺內(nèi)注射法屬于原位移植模型，因肝臟轉(zhuǎn)移瘤形成所需時(shí)間長(zhǎng)造成荷瘤生存周期長(zhǎng)，4 周左右才可形成胰腺原位瘤，培養(yǎng)期間動(dòng)物的死亡率較高，因而肝轉(zhuǎn)移成瘤率并不高。1984年，Kozlowski 等［2］首次采用脾臟內(nèi)移植瘤細(xì)胞的方法建立肝轉(zhuǎn)移模型，該方法具有培養(yǎng)時(shí)間短、轉(zhuǎn)移瘤形成率高、符合血行轉(zhuǎn)移途徑的優(yōu)勢(shì)，4 周左右即可形成肝臟轉(zhuǎn)移瘤，很快被用于結(jié)腸癌和胃癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤的肝轉(zhuǎn)移模型研究。根據(jù)已有文獻(xiàn)檢索，國(guó)內(nèi)目前罕有經(jīng)脾注射鼠Panc-2 細(xì)胞來(lái)建立胰腺癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的報(bào)道，本文嘗試建立胰腺癌經(jīng)脾肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，為胰腺癌肝轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的研究以及抗腫瘤藥物的篩選提供一個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，并對(duì)部分轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的基因表達(dá)水平的變化進(jìn)行初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株 18 只5 周齡，體質(zhì)量為16～18 g的C57/BL6小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，均置于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。鼠胰腺癌Panc-2細(xì)胞株（獲贈(zèng)于日本金沢大學(xué)Mukaida Naofumi教授）（Panc-2 源自于胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞，能在裸鼠上成瘤，屬于胰腺低分化腺癌，侵襲力較強(qiáng)，容易制造移植和轉(zhuǎn)移模型）。

1.1.2 主要材料和試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Biosera；TRIzol 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa BIO INC；SYBR Premix Ex TaqTM 購(gòu)于日本TaKaRa BIO INC；PCR 引物購(gòu)于上海華津生物科技有限公司；美國(guó)ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System，等。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 本研究獲得復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照國(guó)家衛(wèi)生研究所的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物福利倫理指南進(jìn)行。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Panc-2 細(xì)胞，以PBS 重懸，配制成瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，錐蟲(chóng)藍(lán)染色證實(shí)細(xì)胞活力在98%以上。腹腔注射麻醉成功后，小鼠取仰臥位，用0.5%的碘伏消毒。取左上腹縱行切口，長(zhǎng)1.0 cm左右，進(jìn)腹顯露脾臟，將其輕輕拖出腹腔外，脾下極進(jìn)針約1.0 cm，用無(wú)齒鑷夾持住脾臟下極的中部（注射針尖略向后方），實(shí)驗(yàn)組12只小鼠分別緩慢注入瘤細(xì)胞懸液50 μL（總計(jì)5×105個(gè)腫瘤細(xì)胞），可見(jiàn)脾包膜迅速鼓起、變白。注射結(jié)束，待脾臟顏色轉(zhuǎn)紅，快速拔針，迅速用碘伏棉球壓迫針眼至少5 min，然后將脾臟送回，全層關(guān)腹。采用同樣的操作方法，將對(duì)照組6 只小鼠注射等量的PBS 緩沖液。術(shù)后小鼠常規(guī)喂養(yǎng)。待小鼠培養(yǎng)4周時(shí)，頸椎脫臼法處死并解剖小鼠，觀察脾臟成瘤情況、腹腔內(nèi)有無(wú)肝臟轉(zhuǎn)移以及其他部位轉(zhuǎn)移。取脾臟移植瘤和肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織，行蘇木精-伊紅（H＆E）染色，常規(guī)病理學(xué)檢查。并留取部分脾臟移植瘤體組織、肝臟轉(zhuǎn)移灶及其配對(duì)癌旁組織放置于-80℃冰箱保存（癌旁組織，通常是指病變部位旁2 cm 之內(nèi)的組織區(qū)域，結(jié)合小鼠肝臟體積較小，本文描述的肝轉(zhuǎn)移灶癌旁組織均取自肝轉(zhuǎn)移灶旁0.5～1 cm之內(nèi)的肝組織。）。

1.2.2 轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的基因表達(dá)水平檢測(cè) 首先采用Trizol 法（參考Invitrogen TRIzol 試劑使用說(shuō)明書(shū)）分別提取脾臟移植瘤組織、肝轉(zhuǎn)移瘤組織以及肝轉(zhuǎn)移瘤灶旁肝組織總RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR（TaKa-Ra PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒），將獲得的cDNA 進(jìn)行qRT-PCR，選用SYBR Premix Ex TaqTM 試劑，按照兩步法進(jìn)行［3-4］。最后使用軟件RQ manager 1.2.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出相關(guān)分子的基因在不同組織中的表達(dá)fold change值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 5.0 及SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用x±s表示，樣本間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)組1只小鼠在第4周死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)該小鼠出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移伴腹膜多發(fā)轉(zhuǎn)移，余11只小鼠活力減弱，遂終止實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組12只小鼠中10只出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移瘤，總體的肝臟成瘤率為83.33%，解剖發(fā)現(xiàn)：12只小鼠腹腔內(nèi)均見(jiàn)有較多的血性腹水，脾臟均于注射部位出現(xiàn)單一的種植瘤結(jié)節(jié)；其中10只肝臟表面及切面見(jiàn)有大小不等的灰黃色病灶，彌散分布，部分融合成塊；此外，除死亡的1只小鼠腹腔內(nèi)見(jiàn)多發(fā)灰白色小結(jié)節(jié)，余11只小鼠均未見(jiàn)明顯腹膜結(jié)節(jié)形成。肝臟病灶行病理學(xué)檢查，鏡下見(jiàn)部分組織呈實(shí)性片狀生長(zhǎng)，少數(shù)有腺管形成，細(xì)胞體積大，核大、深染，異型明顯，可見(jiàn)小核仁，核分裂相多見(jiàn)，間質(zhì)少，體積較大的病灶中央多可見(jiàn)片狀壞死鈣化灶，壞死區(qū)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核染色質(zhì)絮狀或邊集、細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜溶解破裂、細(xì)胞自溶等細(xì)胞壞死現(xiàn)象，符合胰腺導(dǎo)管腺癌的特征。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠胰腺癌經(jīng)脾肝轉(zhuǎn)移模型成功建立。對(duì)照組小鼠活動(dòng)如常，解剖后觀察脾臟和肝臟紅潤(rùn)，均未見(jiàn)結(jié)節(jié)形成（圖1）。

2.2 胰腺癌肝轉(zhuǎn)移部分轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的基因表達(dá)水平

采用熒光定量PCR的方法比較脾臟移植瘤灶、肝轉(zhuǎn)移灶及轉(zhuǎn)移灶旁的部分與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的基因表達(dá)水平。在軟件RQ manager 1.2.1中設(shè)定分子在肝臟轉(zhuǎn)移癌旁肝組織的基因表達(dá)量為1，則在脾臟移植瘤灶和肝轉(zhuǎn)移灶中的基因相對(duì)表達(dá)量均大于1的分子有CCL-17、CCL-22、CD44、CXCL-3、CXCL-5、CXCR2、CXCR7、FGF-2、FGF-7、MMP2、MMP3、MMP9、PDGFα、PDGF-β、PDGFR-α、PDGFR-β、TGF-β1、TGF-β3、UPA、UPAR。除CD44外，其余分子在肝轉(zhuǎn)移灶和癌旁肝組織中的表達(dá)量有顯著差異（P＜0.05），提示這些分子在肝轉(zhuǎn)移灶的基因表達(dá)量高于癌旁正常肝組織，對(duì)胰腺癌的肝臟轉(zhuǎn)移可能發(fā)揮促進(jìn)作用。基因相對(duì)表達(dá)量均小于1 的分子有Ang-2、BAK、BAX、E-cad、HGF、ITGA2、ITGB1、VEGF。這些分子在肝轉(zhuǎn)移灶與癌旁肝組織中表達(dá)量有顯著差異（P＜0.05），提示這些分子在肝轉(zhuǎn)移灶的基因表達(dá)量低于癌旁正常肝組織，對(duì)胰腺癌的轉(zhuǎn)移具有抑制作用。與脾臟癌組織表達(dá)量相比，CCL-17、CXCL-5、FGF-2、MMP3在肝臟轉(zhuǎn)移癌組織表達(dá)水平高（P＜0.05），CD44、FGF7、MMP2、Ang-2、E-cad在肝臟轉(zhuǎn)移癌組織表達(dá)水平低（P＜0.05），而CCL-22、CXCL-3、CXCR2、CXCR7、MMP9、PDGF-α、PDGF-β、PDGFRα、PDGFR-β、TGF-β1、TGF-β3、UPA、UPAR、BAK、BAX、HGF、ITGA2、ITGB1、VEGF在兩者中的表達(dá)無(wú)顯著學(xué)差異（P＞0.05，表1，圖2）。

圖1 動(dòng)物模型構(gòu)建

表1 不同組織相關(guān)轉(zhuǎn)移分子的基因相對(duì)表達(dá)情況

表1 不同組織相關(guān)轉(zhuǎn)移分子的基因相對(duì)表達(dá)情況（續(xù)表1）

圖2 不同組織相關(guān)轉(zhuǎn)移分子的基因相對(duì)表達(dá)量柱形圖

3 討論

癌細(xì)胞的侵襲能力是決定癌細(xì)胞能夠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的最關(guān)鍵因素，有效的接種方法也是影響其能否發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素之一。通過(guò)腫瘤細(xì)胞注射法，使用不同的途徑建立胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，包括血管內(nèi)注射法［5］、腹腔內(nèi)注射法、動(dòng)脈內(nèi)注射法、脾內(nèi)注射法、肝內(nèi)注射法以及胰腺內(nèi)注射法。胰腺內(nèi)注射法或者胰腺內(nèi)瘤組織移植法均屬于原位移植模型，因小鼠荷瘤生存周期長(zhǎng)，培養(yǎng)期間動(dòng)物的死亡率較高，因而肝轉(zhuǎn)移成瘤率并不高。脾內(nèi)注射法具有培養(yǎng)時(shí)間短、轉(zhuǎn)移瘤形成率高、符合腫瘤血行轉(zhuǎn)移途徑的優(yōu)勢(shì)，4 周左右即可形成有效的肝轉(zhuǎn)移病灶。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了小體積脾內(nèi)注射法進(jìn)行建模。

本實(shí)驗(yàn)采用的小體積脾內(nèi)注射法由Kopper 等［6］首次提出，最大程度地模擬了人胰腺癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程，是自發(fā)肝轉(zhuǎn)移模型的理想選擇。該方法的常見(jiàn)并發(fā)癥是出血和腫瘤細(xì)胞滲漏，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的小鼠模型均無(wú)明顯出血，僅1只小鼠出現(xiàn)腹腔內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中，1只小鼠在第4周出現(xiàn)死亡，解剖發(fā)現(xiàn)形成肝臟及腹腔內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移灶，考慮惡性腫瘤本身影響了小鼠的代謝及生長(zhǎng)。此外，2只小鼠僅形成脾臟移植瘤，未出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移瘤，考慮與培養(yǎng)周期不夠長(zhǎng)、未選擇高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞系、瘤株活性降低、操作技術(shù)誤差以及裸鼠內(nèi)環(huán)境影響和瘤細(xì)胞的多潛能分化有關(guān)。本研究中肝轉(zhuǎn)移成瘤率為83.33%，實(shí)驗(yàn)組小鼠數(shù)量為12只，仍有待提高，從而進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的有效性與可靠性。近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道［7］采用表達(dá)綠色熒光蛋白的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行胰腺尾部注射，構(gòu)建胰腺癌原位模型，實(shí)現(xiàn)了胰腺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程非侵入性實(shí)時(shí)成像，用于研究新型療法對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的治療效果。

在腫瘤診斷時(shí)，胰腺癌患者常已出現(xiàn)浸潤(rùn)周圍組織的局部晚期癌灶，或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［8-9］。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞和宿主微環(huán)境之間平衡作用調(diào)控的多種連續(xù)步驟，胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的步驟，從理論上說(shuō)包括轉(zhuǎn)化、增殖、血管生成、侵襲、循環(huán)、溢出、肝臟中增殖［10-12］。

在腫瘤的生長(zhǎng)、增殖階段，微環(huán)境中的許多分子和相應(yīng)受體結(jié)合，引發(fā)一系列細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和遷移。在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)移癌灶中基因相對(duì)表達(dá)量高于癌旁肝組織的分子PDGF 及其受體PDGFR、FGF-2［13］的過(guò)表達(dá)或過(guò)度活化，BAK、BAX等促凋亡蛋白的低表達(dá)［14-16］，共同促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。TGF-β在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用：在腫瘤發(fā)生的起始階段TGF-β扮演著腫瘤抑制者的角色，而在進(jìn)展期TGF-β發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用［17］。

直徑＜2 mm 的腫瘤可以通過(guò)擴(kuò)散的方式獲得氧和營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)腫瘤體積增加時(shí)，需要建立血管供應(yīng)［18］，不僅保證了腫瘤擴(kuò)張的供給，而且為腫瘤細(xì)胞提供了血源性傳播的渠道。誘導(dǎo)血管生成的過(guò)程受控于腫瘤和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的促進(jìn)和抑制血管生成的分子［19］，這些分子包括VEGF［20］、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子［21］、IL-8［22］等，均已被證實(shí)在胰腺癌中表達(dá)。除此之外，PDGF及其受體PDGFR涉及多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制并在血管生成中起重要作用［23］。本研究結(jié)果顯示VEGF、Ang-2在脾臟癌灶、肝臟轉(zhuǎn)移癌灶中的基因表達(dá)水平低于肝轉(zhuǎn)移灶旁肝組織，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF、Ang-2 在前兩者中的基因表達(dá)水平高于后者［24］，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用?？紤]到肝臟組織血供豐富，腫瘤邊緣區(qū)血管生成活躍，而腫瘤的中心或內(nèi)部血管稀疏甚至缺如，胰腺癌本身又是乏血供腫瘤，因此，胰腺癌組織相對(duì)肝組織來(lái)說(shuō)，VEGF、Ang-2 的基因相對(duì)表達(dá)量可能較低，但并不能否認(rèn)兩者對(duì)胰腺癌增殖及侵襲的促進(jìn)作用。

在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，可能伴隨鈣黏素分子下調(diào)，特別是E-cadherin、ITGA2、ITGB-1等黏附分子的表達(dá)下降，促使腫瘤細(xì)胞間黏附力下降，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致［25-26］。腫瘤侵襲過(guò)程得益于增強(qiáng)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力、減弱的黏附力以及Ⅳ型膠原蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9、絲氨酸蛋白酶（t-PA、u-PA）等降解酶的分泌，進(jìn)展更加有利［27-28］。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一種非隨機(jī)的、有組織器官選擇性的高度組織化的過(guò)程，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移受趨化因子的嚴(yán)格調(diào)控［29-30］。在本實(shí)驗(yàn)中，CCL-17、CCL-22、CXCL-3等趨化分子的高表達(dá)，說(shuō)明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用，但具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞形成的栓子可以被毛細(xì)血管床捕獲，誘導(dǎo)內(nèi)皮反應(yīng)，通過(guò)特異的細(xì)胞表面受體整合素、鈣黏蛋白和CD44 抗原等，與基底膜上的糖蛋白（如層黏連蛋白）連接［31-32］。緊跟著黏附的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞溢出進(jìn)入到肝臟實(shí)質(zhì)，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)胰腺腫瘤細(xì)胞的增殖受控于生長(zhǎng)促進(jìn)受體和抑制因子的相互作用［33-34］。研究表明［35-36］，HGF-c-met 信號(hào)通路參與胰腺癌的浸潤(rùn)、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，主要通過(guò)腫瘤實(shí)質(zhì)與間質(zhì)的相互作用。但在本實(shí)驗(yàn)中HGF的表達(dá)量在癌旁肝組織高于癌組織，其原因可能歸結(jié)于肝組織是分泌該生長(zhǎng)因子的主要場(chǎng)所。

胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的結(jié)果取決于胰腺腫瘤細(xì)胞與肝臟環(huán)境的相互作用，這些參與其中的分子識(shí)別和驗(yàn)證是證明腫瘤轉(zhuǎn)移非隨機(jī)理論的基礎(chǔ)［37］。本研究利用小鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)移分子進(jìn)行初篩，結(jié)果與人體胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)基本一致，可以作為轉(zhuǎn)移機(jī)制及腫瘤藥物研發(fā)的理想模型。但本研究仍然存在一定的局限性：建模數(shù)量較少；考慮到納入研究的相關(guān)轉(zhuǎn)移分子數(shù)量較多，未進(jìn)行Western blot、免疫組織化學(xué)染色驗(yàn)證qRT-PCR 結(jié)果，未研究因子表達(dá)量之間的相關(guān)關(guān)系；對(duì)于部分轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的研究?jī)H進(jìn)行初篩，未對(duì)涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行深入的研究，未來(lái)對(duì)這些方面可以繼續(xù)探索。

綜上所述，經(jīng)脾小體積注射法成功構(gòu)建胰腺癌動(dòng)物模型，為篩選抗腫瘤藥物和研究腫瘤轉(zhuǎn)移行為提供了有效模型，應(yīng)用前景較好；胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的過(guò)程，涉及眾多因素。深入揭示和理解胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，將提供更多的胰腺癌預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)，有助于制定新的、有效的治療策略，從而有望改善治療效果，提高胰腺癌患者的生存率。