郭芮吉 韓剛 方霞 孫濱 崔恒慶 周晟博 孫文海 王斌

短指（Brachydactyly，BD）是一種以指體縮短為特征的先天畸形，患者的指骨、掌骨或兩者同時(shí)發(fā)育異常[1-2]。短指通常始于胚芽發(fā)生時(shí)（胚胎第8周）[3]，可獨(dú)立發(fā)生，也可作為綜合征的表型之一，如波蘭綜合征、Adamse-Oliver綜合征，并可伴發(fā)并指、多指等手部先天畸形[4－8]。該畸形診斷以體格檢查、影像檢查為主，X片即可顯示其骨骼解剖特點(diǎn)。分離型短指尚無(wú)有效的產(chǎn)前診斷方法。發(fā)育早期，胎兒超聲無(wú)法明顯觀察短指畸形。妊娠11周時(shí)絨毛膜絨毛取樣或14周時(shí)羊膜穿刺可鑒定胎兒是否攜帶致病基因[1]。因此，研究短指的致病基因?qū)ζ湓\斷和治療十分必要。

1 資料與方法

1.1 患者資料

該短指畸形家系中短指畸形患者有3人 （圖1）。先證者右手Ⅲ1拇指、中指短小，X線示拇指末節(jié)、第3掌骨短小。Ⅲ2右手拇示中環(huán)小指短小，X線示五指掌骨均短小。Ⅱ1雙手拇指短小明顯，X片示拇指末節(jié)短小。遺傳方式是常染色體顯性遺傳?；颊唛g表現(xiàn)度存在差異。先證者臨床化驗(yàn)結(jié)果可知，堿性磷酸酶 51 U/L （正常 35～105 U/L），血鈣 2.27 nmol/L （正常2.15～2.50 nmol/L），甲狀旁腺素5.14 pmol/L（正常 1.60～6.90 pmol/L）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：SH9H-2018-T50-2），患者及親屬均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

抽?、?、Ⅲ2及Ⅱ1等3位患者和正常成員Ⅱ2的靜脈血，按標(biāo)準(zhǔn)操作流程，采用Dneasy blood and tissue kit（Qiagen No.69506）對(duì)全血樣本進(jìn)行 DNA的抽提及純化，并用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。抽提DNA于-80℃下保存。

1.2.2 全外顯子測(cè)序

本研究對(duì)Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅲ1、Ⅲ2的基因組進(jìn)行了全外顯子測(cè)序。Agilent外顯子捕獲測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程處理基因組DNA。使用QubitR2.0 Fluorometer檢測(cè)所建文庫(kù)濃度，Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)大小。按照cBot User Guide指示，在測(cè)序儀（Illumina HiSeq X）配套的cBot上完成 Cluster生成、第一向測(cè)序引物雜交。按照HiSeq X User Guide準(zhǔn)備試劑測(cè)序，將攜有cluster的flow cell上機(jī)。選用pair-end程序，進(jìn)行paired end 2×150 nt multiplex測(cè)序。測(cè)序過(guò)程由data collection software（Illumina）進(jìn)行控制。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為Fastq文件格式，并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。采用BWA(0.7.12)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，基因組比對(duì)的參考基因組版本為hg19，統(tǒng)計(jì)捕獲效率。采用GATK （version 3.5）分析工具Haplotype-Caller進(jìn)行單核苷酸變異和插入缺失檢測(cè)，并用ANNOVAR軟件注釋變異結(jié)果。

1.2.4 Sanger測(cè)序

反應(yīng)體系 20 μL（Toyobo）：KODfx buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，primer 0.6 μL，DNA 4 μL，KODfx 0.4 μL，H2O 0.4 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)，94 ℃10 sec，60 ℃ 30 sec，68 ℃ 1 min，共 35 個(gè)循環(huán)。 引物序列：F-GTTTCTGGTGAGTCGAGCCT，R-GGCCTCCCAACTTTTGACCTA。

圖1 先天性短指家系圖及其臨床表現(xiàn)Fig.1 Pedigree of a family with brachydactyly and its clinical features

2 結(jié)果

全外顯子測(cè)序顯示，所有樣本比對(duì)到參考基因組的比例約為80%，覆蓋度在99%以上，測(cè)序深度在80X以上。Ⅲ1檢測(cè)到單核苷酸變異84 029個(gè)，插入缺失16 080個(gè)。Ⅲ2檢測(cè)到單核苷酸變異84 587個(gè)，插入缺失16 185個(gè)。Ⅱ1檢測(cè)到單核苷酸變異83 602個(gè)，插入缺失16 236個(gè)。Ⅱ2檢測(cè)到單核苷酸變異84 768個(gè)，插入缺失17 061個(gè)。通過(guò)外顯子區(qū)域和非同義變異篩選，數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾、疾病模式篩選，發(fā)現(xiàn)該家系3名患者（Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅱ1）在GNAS基因外顯子上均存在1個(gè)雜合錯(cuò)義突變（NM_001077488:exon13:c.A1145T），導(dǎo)致其編碼蛋白中原先的天冬氨酸被替換為纈氨酸（p.D382V）（圖2）。該點(diǎn)突變尚未在ExAC[9-10]、Kaviar[11]數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道。突變致病性預(yù)測(cè)軟件一致預(yù)測(cè)此突變?yōu)橹虏⊥蛔?。通過(guò)PCR擴(kuò)增、一代測(cè)序驗(yàn)證3名患者均攜帶該突變，同時(shí)先證者母親（Ⅱ2）不攜帶該突變，與全外顯子測(cè)序結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因突變的致病性。

圖2 GNAS基因Sanger測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sanger sequencing results of GNAS gene

3 討論

短指是10種手畸形中的一類，按解剖改變可分為A～E五型[2]。其中，D型表現(xiàn)為拇指末節(jié)的縮短，E型表現(xiàn)為掌骨的縮短，而掌骨縮短常為部分綜合征的特征性表現(xiàn)，部分E型短指患者可伴有輕度身材矮小、圓臉等表現(xiàn)[12]。若短指明顯影響外觀或功能時(shí)，可采取分指術(shù)、骨延長(zhǎng)[13]、足趾移植術(shù)[14]等方法治療，但效果并不理想。由于缺乏對(duì)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也很難對(duì)疾病進(jìn)行早期干預(yù)。

本研究通過(guò)全外顯子和一代測(cè)序，在短指家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的GNAS雜合錯(cuò)義突變位點(diǎn)（NM_001077488:exon13:c.A1145T）， 其編碼蛋白中原先的天冬氨酸被替換為纈氨酸（p.D382V）。在人類先天性肢體畸形中，常可檢測(cè)到GNAS突變[15-16]。GNAS基因位于第20號(hào)染色體q13.3上，包含13個(gè)外顯子，編碼刺激性G蛋白的α亞單位（alpha-subunit of the stimulatory G protein，Gsα）和剪接變體[17]。1997年，Sunahara等[18]報(bào)道了 Gsα的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Gsα由R as結(jié)構(gòu)域和α螺旋結(jié)構(gòu)域兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)組成[19]。1998 年，Dumas等[20]發(fā)現(xiàn) Gsα 與其下游腺苷酸環(huán)化酶的相互作用。甲狀旁腺激素（PTH）通過(guò)其G蛋白偶聯(lián)受體甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)肽受體作用于幾種特定組織，在G蛋白偶聯(lián)受體接收到信號(hào)后，Ras結(jié)構(gòu)域和α螺旋結(jié)構(gòu)域間的GDP被釋放，結(jié)合GTP，并與刺激性G蛋白β亞基分離，進(jìn)而和腺苷酸環(huán)化酶相互作用，促進(jìn)cAMP產(chǎn)生，激活下游的蛋白激酶A催化亞基，通過(guò)活化的維生素D直接或間接調(diào)節(jié)血清鈣水平，影響生長(zhǎng)發(fā)育[21-23]。

c.A1145T突變位于第13號(hào)外顯子上，而第12、13號(hào)外顯子編碼G蛋白偶連受體與之相互作用的區(qū)域[24]，原本親水性的天冬氨酸被替代為疏水性的纈氨酸，可能使G蛋白偶連受體與Gsα之間的相互作用發(fā)生異常，導(dǎo)致PTH作用于G蛋白偶連受體的信號(hào)無(wú)法正常傳導(dǎo)至Gsα，從而使Gsα無(wú)法與GTP結(jié)合，影響其下游腺苷酸環(huán)化酶的作用。GNAS基因突變后，其編碼的Gsα功能受損，造成單倍體劑量不足，影響成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，可導(dǎo)致短指和/或異位骨化[25]。其突變和/或甲基化異常可導(dǎo)致假性甲狀旁腺功能減退癥（Pseudohypoparathyroidism，PHP）。 PHP可分為 PHP 1A 型、PHP 1B型、假性甲狀旁腺功能減退癥（PPHP）和進(jìn)行性骨異位增生 （Progressive osseous heteroplasia，POH）4個(gè)亞型[21]。其中，PPHP的臨床表現(xiàn)為Albright遺傳性骨營(yíng)養(yǎng)不良（Albright hereditary osteodystrophy，AHO），即身材矮小、圓臉、肥胖、短指等，但無(wú)甲狀旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）抵抗表現(xiàn)，通常呈顯性遺傳[21，26]。GNAS基因座前存在編碼反義轉(zhuǎn)錄本的NESP55基因，在腎小管、甲狀腺、垂體等組織中，存在母源性NESP55啟動(dòng)子的甲基化，故NESP55基因無(wú)或僅有較少轉(zhuǎn)錄發(fā)生，而父源性NESP55啟動(dòng)子在上述組織中無(wú)甲基化，故在NESP55基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生后，父源性GNAS基因在正常個(gè)體的特定組織中被沉默[27]。當(dāng)母源性GNAS基因發(fā)生突變時(shí)，可導(dǎo)致甲狀旁腺素抵抗和高磷血癥；當(dāng)父源性GNAS發(fā)生突變時(shí)，則可導(dǎo)致PPHP，但不一定出現(xiàn)所有的AHO特征[17，28]。本研究中，先證者的GNAS基因突變?yōu)殡s合型，且該突變遺傳自其父親。臨床化驗(yàn)結(jié)果顯示，先證者血鈣、PTH均在正常范圍內(nèi)，無(wú)PTH抵抗表現(xiàn)，故其表型屬于PPHP，符合GNAS基因印跡遺傳特點(diǎn)。該家系先證者Ⅲ1右手拇指末節(jié)、第3掌骨短小，Ⅲ2右手五指掌骨均短小，Ⅱ1雙手拇指末節(jié)短小，Ⅲ1、Ⅲ2屬于E型短指，Ⅱ1屬于D型短指，其表型存在一定變異度。目前尚無(wú)系統(tǒng)研究分析GNAS基因型和臨床表現(xiàn)型的關(guān)系，其規(guī)律有待進(jìn)一步研究與探討。

本研究在短指家系中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的GNAS雜合錯(cuò)義突變位點(diǎn)，攜帶該突變基因可導(dǎo)致拇指末節(jié)、五指掌骨短小表現(xiàn)。這個(gè)突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展了GNAS基因的突變譜，豐富了攜帶GNAS突變的短指表型譜，為短指基因診斷、遺傳咨詢及治療提供了新的依據(jù)。