馮濤， 張麗萍

（1.菏澤市中醫(yī)醫(yī)院，山東菏澤 274000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬威海醫(yī)院，山東威海 264200）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是腰腿痛最為常見的原因，是臨床常見病，好發(fā)于30～50歲的體力勞動者或者平時缺乏鍛煉的人群[1]。腰椎間盤突出等一系列的脊柱退行性病變均會對神經(jīng)根造成不同程度的壓迫，進而導(dǎo)致神經(jīng)損傷并誘發(fā)神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯，臨床表現(xiàn)為慢性腰背痛與坐骨神經(jīng)痛等癥狀，本病的根本病理變化在于病變部位神經(jīng)根的損傷。而病變部位發(fā)生周圍神經(jīng)損傷之后，會造成背根結(jié)神經(jīng)細胞凋亡增多，這種異常的神經(jīng)細胞凋亡會影響到患者后期生理功能的恢復(fù)[2-4]。所以，在治療過程中，減少神經(jīng)損傷之后出現(xiàn)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡，具有十分重要的臨床意義。本實驗以腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛模型大鼠為研究對象，通過針刀松解法治療后，檢測各組大鼠脊髓谷氨酸（Glu）、脊髓背角P物質(zhì)（SP）、下丘腦β-內(nèi)啡肽（β-EP）、血清白細胞介素1β（IL-1β）含量的變化，探討針刀松解法對腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛模型大鼠鎮(zhèn)痛、抗炎效果與機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量240～270 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（京）2016-0003，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心二級實驗室，室溫維持在20℃。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛，北京化學(xué)試劑廠，批號：160902；碘伏，武漢同濟美迪生科技有限公司，批號：20160802；酒精，北京貞玉民生藥液有限公司，批號：201607002；谷氨酸ELISA試劑盒、β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒、白細胞介素-1β ELISA試劑盒和P物質(zhì)ELISA試劑盒，均由北京尚柏生物科技有限公司提供。HZ系列一次性針刀規(guī)格為0.4 mm×40 mm，漢章牌，北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司；LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)發(fā)公司；環(huán)球牌無菌針灸針，規(guī)格為0.2 mm×13 mm，蘇州針灸醫(yī)療器材有限公司；5415R型高速離心機，德國Eppendorf公司；FS/FAS5030石蠟切片機，德國LETIZ公司；BX61顯微鏡，日本Olympus株式會社；PL-200型熱痛測試儀檢測盒，成都泰盟軟件有限公司。

1.3 分組與模型制備[5]

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為正常組、模型組、針刀組和電針組，共4組，每組各10只。除正常組外，其余各組大鼠用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）進行腹腔麻醉，背部脫毛之后以俯臥位固定在鋪有無菌手術(shù)巾的手術(shù)臺上面；將手術(shù)區(qū)域暴露出來，用碘伏對大鼠暴露的手術(shù)部位進行消毒處理；將L3-4棘突作為中心區(qū)域，于大鼠背部正中部位取大約3 cm長的切口，依次切開大鼠背部的皮膚、皮下組織與腰背筋膜層；將其背部組織進行鈍性分離，直至暴露腰椎旁??；將其牽開后，用微型咬骨鉗將左側(cè)L4棘突及右側(cè)椎板、關(guān)節(jié)突咬除，暴露L4神經(jīng)根，以4-0鉻制腸線環(huán)扎在L4神經(jīng)根處，其松緊度以腸線接觸到神經(jīng)根但無明顯壓迫為宜。將切口進行逐層地縫合，并灑上青霉素粉末，術(shù)后3 d內(nèi)每天給予大鼠青霉素肌注預(yù)防感染，劑量為8萬U/d。

待大鼠清醒后，觀察大鼠雙下肢是否有癱瘓的情況出現(xiàn)（主要表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)或者足外翻），以此來判定造模是否對大鼠造成了脊髓的損傷。如果沒有癱瘓的情況，就對大鼠兩側(cè)的后足檢測熱刺激痛覺過敏情況：將大鼠放置在PL-200型熱痛測試儀的檢測盒之中，輻射熱光源經(jīng)過底部的玻璃板聚焦于大鼠一側(cè)足底的后半部位，其光斑直徑為5 mm。把大鼠從開始照射到產(chǎn)生縮爪的時間記錄下來。每次測試間隔至少為5 min，測量3次取其平均值，對大鼠的兩側(cè)后足進行交替檢測。根據(jù)各次檢測的平均值求出大鼠兩后足進行熱刺激后發(fā)生縮爪的潛伏期，計算公式：縮爪的潛伏期=術(shù)前側(cè)潛伏期-術(shù)后潛伏期。差值比正常組大鼠的差值大則說明潛伏期下降，對熱痛反應(yīng)發(fā)生了痛覺過敏現(xiàn)象，提示造模成功。

1.4 干預(yù)方法

正常組與模型組，均常規(guī)飼養(yǎng)。針刀組：造模3 d后，給予大鼠針刀干預(yù)治療。施行針刀時先用乙醚將大鼠麻醉1 min，選用HZ系列一次性針刀進行干預(yù)，其治療點選擇于患椎上下棘之間、患椎上下棘間旁開0.1 cm處，患椎上下橫突，臀上皮神經(jīng)走行區(qū)域、坐骨神經(jīng)出口處等部位的條索、結(jié)節(jié)、壓痛點等位置，每次選擇2-3個點進行松解。每周干預(yù)1次，共干預(yù)3次。電針組：造模3 d后，給予大鼠電針干預(yù)治療。取大鼠的環(huán)跳穴、委中穴。參考《實驗針灸學(xué)》[6]教材，并結(jié)合動物比較學(xué)方法進行取穴，依據(jù)比較解剖取穴法配合模擬骨度取穴法最終確定穴位的具體位置。選用一次性無菌針灸針，針刺后連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀對大鼠進行電針刺激，頻率為2～100 Hz，電流強度以造成大鼠后肢輕度抖動為宜，每次刺激20 min。隔天治療1次，每周治療3次，共治療3周。

1.5 取材與檢測指標

實驗結(jié)束后24 h內(nèi)取材，用10%水合氯醛溶液0.0375 mg/kg腹腔麻醉大鼠，快速取出其脊髓的L4-6段，分成2個部分。第一部分放置于液氮罐內(nèi)凍存，以蔡堯輝毛細管電泳分析Glu含量的變化。第二部分放置于以4%多聚甲醛為主要成分的固定液中固定6～12 h后，梯度酒精脫水處理，用二甲苯進行透明處理；石蠟包埋后，作連續(xù)冠狀切片，厚度約為5 μm，用于免疫組織化學(xué)方法分析SP含量的變化。

實驗結(jié)束后，大鼠斷頭取血6 mL，4℃，離心機3 000 r/min離心15 min后，進行血清分離，放射免疫法進行大鼠IL-1β含量的測定。

快速分離大鼠腦組織，冰盤上分離出大鼠下丘腦，制成腦勻漿，以放射免疫法對大鼠下丘腦β-EP的含量進行測定。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，運用單因素方差分析，等級資料應(yīng)用Ridit分析。組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）。當方差分析有顯著意義時，進行多組間兩兩比較；在方差齊時采用Bonferroni法，而方差不齊時采用Tamhane法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脊髓Glu毛細管電泳比較

表1結(jié)果顯示：模型組大鼠脊髓Glu的含量明顯上升，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；電針組和針刀組大鼠脊髓Glu的含量明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠脊髓Glu毛細管電泳比較Table 1 Comparison of the content of spinal Glu in various groups[±s，c/（μmol·L-1）]

表1 各組大鼠脊髓Glu毛細管電泳比較Table 1 Comparison of the content of spinal Glu in various groups[±s，c/（μmol·L-1）]

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組電針組針刀組Glu 64.12±10.68 113.62±18.26①66.72±11.93②65.37±10.01②N 10 10 10 10

2.2 各組大鼠SP免疫組化結(jié)果比較

正常組大鼠P物質(zhì)的免疫陽性反應(yīng)物主要集中在脊髓的Ⅰ～Ⅱ?qū)樱Ｐ徒M大鼠脊髓Ⅰ～Ⅳ層都能看到陽性反應(yīng)物，見圖1。模型組積分光密度升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；電針組與針刀組積分光密度明顯改善，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠SP免疫組化結(jié)果比較Table 2 Comparison of the SP immunohistochemical results in various groups （±s）

表2 各組大鼠SP免疫組化結(jié)果比較Table 2 Comparison of the SP immunohistochemical results in various groups （±s）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組電針組針刀組積分光密度10.98±1.52 33.85±8.03①26.54±6.86②24.61±3.42②N 10 10 10 10

圖1 各組大鼠P物質(zhì)的免疫陽性反應(yīng)物（免疫組化，×100）Figure 1 Comparison of the positive immune reactants of substance P in various groups（by immunohistochemical method，×100）

2.3 各組大鼠下丘腦β-EP及血清IL-1β含量比較

表3結(jié)果顯示：模型組大鼠下丘腦中β-EP及血清IL-1β的含量均明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。電針組與針刀組大鼠下丘腦中β-EP及血清IL-1β的含量均明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 各組大鼠下丘腦β-EP及血清IL-1β含量比較Table 3 Comparison of the contents of hypothalamic β-EP and serum IL-1β in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表3 各組大鼠下丘腦β-EP及血清IL-1β含量比較Table 3 Comparison of the contents of hypothalamic β-EP and serum IL-1β in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組電針組針刀組IL-1β 0.41±0.06 0.71±0.42①0.44±0.32②0.42±0.06②N 10 10 10 10 β-EP 104.31±45.63 172.13±40.76①112.72±26.65②110.15±28.69②

3 討論

針刀療法是一種治療慢性軟組織損傷的新療法，其將傳統(tǒng)針灸方法與西醫(yī)外科手術(shù)刀相結(jié)合，能夠松解黏連、刮除瘢痕、消除痙攣，恢復(fù)軟組織的動態(tài)力學(xué)平衡。電針是一種對傳統(tǒng)針灸學(xué)的繼承與發(fā)揚，它結(jié)合了針與電兩種刺激手段，能夠有效地提高臨床療效，且可以較為準確地掌握刺激參數(shù)，并代替了手法運針，節(jié)省人力，故目前廣泛地應(yīng)用于針灸治療當中。

谷氨酸（Glu）廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)之中。研究[7]發(fā)現(xiàn)，Glu能夠促進炎性痛敏的發(fā)生，且對痛敏的維持起到關(guān)鍵的作用，如果抑制Glu釋放或者拮抗Glu與其相應(yīng)的受體發(fā)生結(jié)合都能夠有效地抑制痛敏的形成，明顯減輕疼痛反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠脊髓中Glu的含量較正常組明顯上升，這表明Glu在痛敏及突觸可塑性改變過程中起著極為重要的作用，這與之前的研究結(jié)果基本一致；而電針或者針刀刺激能夠使脊髓Glu的含量有所下降，提示脊髓Glu含量的降低很可能是電針或者針刀鎮(zhèn)痛的機制之一。

P物質(zhì)（SP）及其受體廣泛分布于脊髓的Ⅰ層、Ⅱ?qū)优cⅩ層，并參與疼痛信息的傳遞[8，9]。通過細胞毒的作用，使脊髓背角表達SP受體的神經(jīng)元有所減少，能夠有效地抑制脊髓背角細胞的中樞敏化，這意味著SP是影響痛敏形成與發(fā)展的主要因素[10]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠脊髓中SP的免疫陽性反應(yīng)初級傳入纖維末梢和背角神經(jīng)元釋放的SP增多，而電針組和針刀組SP的積分光密度較模型組明顯下降，說明電針或者針刀對于炎性痛的環(huán)節(jié)很可能是通過抑制脊髓背角中SP的釋放以阻斷痛覺信號的傳遞來實現(xiàn)的。

β-內(nèi)啡肽（β-EP）是由其自身合成的具阿片樣作用的肽類物質(zhì)，是機體鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的主要遞質(zhì)，可以在中樞與外周兩處位置發(fā)揮作用[11]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，β-EP通過β-內(nèi)啡肽能神經(jīng)元的神經(jīng)纖維投射到其相應(yīng)核團部位以抑制疼痛信息的傳遞，比如脊髓背角痛覺信息傳遞的抑制作用；在外周，因為垂體與免疫細胞能夠分泌大量的β-EP入血，這主要通過損傷應(yīng)激組織以緩解疼痛的發(fā)生。研究[12]發(fā)現(xiàn)，β-EP的鎮(zhèn)痛作用主要是通過含β-EP的免疫細胞遷移到炎癥組織中，促進β-EP的釋放，以激活感覺神經(jīng)元周圍末梢上的阿片受體而發(fā)生鎮(zhèn)痛效果。本實驗結(jié)果顯示，電針或者針刀刺激都能夠使下丘腦β-EP的含量顯著下降，提示經(jīng)過電針或者針刀治療，大鼠病變局部的血液循環(huán)得到了改善，其神經(jīng)根的水腫與脫髓鞘變化有所緩解，在病變過程中多種炎癥介質(zhì)的釋放有所減少，組織間的代謝得到了加快，這使得炎性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運與降解加速，這一過程與整個神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)發(fā)生協(xié)同作用，從而降低了β-EP的含量。

白細胞介素-1β（IL-1β）是神經(jīng)與免疫系統(tǒng)之間較為重要的一種傳遞物質(zhì)，在神經(jīng)與免疫系統(tǒng)之間起著重要的調(diào)節(jié)作用，所以被稱作免疫神經(jīng)遞質(zhì)，同時，它也是炎癥形成的中心環(huán)節(jié)[13，14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤突出組織當中IL-1β的含量與根性疼痛呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)過電針或者針刀治療，大鼠血清IL-1β的含量較模型組顯著下降，提示電針或針刀對腰椎間盤突出所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)能夠起到有效的良性調(diào)節(jié)作用，治療后通過減少血清中IL-1β的表達，以使炎癥細胞的聚集、激活及炎癥介質(zhì)的釋放有所減少，減輕白細胞和內(nèi)皮細胞之間的黏附反應(yīng)，使得白細胞浸潤情況的發(fā)生減少，以減緩炎癥反應(yīng)的程度與進程，從而緩解疼痛的癥狀。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠脊髓Glu、脊髓背角SP、下丘腦β-EP、血清IL-1β的含量明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；電針組與針刀組脊髓Glu、脊髓背角SP、下丘腦β-EP、血清IL-1β表達水平明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明針刀和電針治療均可明顯改善腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛癥狀，且針刀效果略優(yōu)于電針。

本實驗提示針刀松解法、電針療法對腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛有明顯的抗炎與鎮(zhèn)痛作用。針刀松解法治療腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛在局部松解作用的基礎(chǔ)上，還通過對神經(jīng)根的直接刺激作用，經(jīng)神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)，激發(fā)下丘腦—垂體—腎上腺軸的調(diào)節(jié)，從神經(jīng)、體液、免疫三個方面共同作用，抑制或減少化學(xué)性致痛因子的釋放，同時加速血液循環(huán)促進致痛因子的代謝，加速神經(jīng)水腫的吸收及無菌炎癥的消退，從而減輕疼痛刺激，緩解癥狀[16-18]。本研究以電針組進行對比，以神經(jīng)電生理、疼痛物質(zhì)變化為切入點，通過實驗探索針刀治療LDH的作用機制，進一步剖析了LDH發(fā)病機制、病理轉(zhuǎn)變，從而有針對性地指導(dǎo)和完善LDH的臨床診療方案，同時也為針刀治療LDH的作用機制提供了實驗支持，完善了其理論研究。