黃大兵，王玲玉，潘躍銀

(中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院 安徽省立醫(yī)院腫瘤化療科，安徽 合肥 230001)

惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的疾病，已經(jīng)成為中國居民主要的死亡原因之一，目前臨床治療主要采用手術、放射治療、化學治療等，缺乏有效的治療手段。日前，國家癌癥中心發(fā)布了最新版的2018中國惡性腫瘤報告，報告顯示2018年中國新增惡性腫瘤病例380.4萬例，死亡病例229.6萬例。在所有發(fā)病的惡性腫瘤中，肺癌為我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其次是胃癌、結直腸癌、肝癌、女性乳腺癌等，這些均是我國常見的惡性腫瘤，其中肺癌發(fā)病率約占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的77%，肺癌死亡率約占全部惡性腫瘤死亡病例的83%。

鴉膽子作為廣譜抗癌藥，用于對抗肺癌[1]、胃癌[2]、結直腸癌[3]、肝癌[4]、女性乳腺癌[5]等，有毒性和不良反應小等優(yōu)點，廣泛用于臨床。從鴉膽子水提取物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素AI、鴉膽子苷AP、鴉膽子苦內酯AD、鴉膽子苦醇和鴉膽丁等30余種苦木內酯類成分?？嗄緝弱ヮ愂区f膽子的特征性成分，多數(shù)有抗癌活性[6]?？嗄緝弱サ目鼓[瘤機制包括：①特異性地抑制拓撲異構酶Ⅱ，從而抑制腫瘤細胞的DNA合成；②誘導細胞凋亡和分化；③對腫瘤細胞耐藥性產生有一定逆轉作用[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子活性成分較多，并對其抗癌作用的分子機制進行了深入的研究，但迄今尚無一種單一的化合物被用于臨床治療癌癥。本研究擬利用網(wǎng)絡藥理學方法將鴉膽子多成分、多靶點、多通路、多疾病的關系網(wǎng)絡進行呈現(xiàn)，探索其有效成分作用的靶點及其治療疾病的作用機制。

1 資料與方法

1.1 鴉膽子主要活性成分查找 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索鴉膽子所含的所有化學成分。根據(jù)TCMSP的推薦，通過口服利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)對所有化學成分進行篩選。OB是指藥物被吸收進入全身循環(huán)系統(tǒng)的程度和速度，是客觀評價藥物口服生物利用度和內在質量的重要指標，也是判斷生物活性分子是否具有藥物潛質的關鍵指標；DL是藥物代謝動力學特性和安全性的總和(包括溶解度、通透性和穩(wěn)定性等)，與化合物理化性質和結構因素的相互作用有關，是評價成藥性優(yōu)劣的關鍵指標，可用于優(yōu)選化合物、解釋活性和DL分析結果、挖掘活性和DL的關系、分析化合物特性、預測體內藥物代謝動力學特征、指導分子結構修飾等?；衔锏腛B、DL越高，表明其越有可能被開發(fā)成為臨床藥物[8-9]。本研究以OB≥30%、DL≥18%作為篩選條件[10]，對鴉膽子活性成分進行進一步篩選。

1.2 構建活性成分-靶標蛋白網(wǎng)絡 DrugBank數(shù)據(jù)庫是唯一將詳細的藥品數(shù)據(jù)(即化學、藥理學和制藥)與綜合藥物靶點信息(即序列、結構和作用通路)相結合的“生物信息學和化學信息學”資源。通過TCMSP導出鴉膽子活性成分，根據(jù)DrugBank獲取活性成分的潛在靶分子，以構建鴉膽子的活性成分-靶標蛋白網(wǎng)絡。

1.3 構建蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction network，PPI) String數(shù)據(jù)庫是一個搜尋PPI的數(shù)據(jù)庫。既包括蛋白質之間的直接物理相互作用，也包括蛋白質之間的間接功能相關性。利用String數(shù)據(jù)庫，置信度(兩個蛋白質相互作用越強連線越粗)設定為0.9，構建這些靶分子的PPI，其中節(jié)點度值最高的基因JUN定義為核心基因，通過癌癥和腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)分析其在多種腫瘤的作用。

1.4 通路富集分析 R語言Cluster profiler包，即基因本體(gene ontology，GO)分析和京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析的R包，可以對基因集合或基因簇進行功能聚類的統(tǒng)計分析和可視化。利用Cluster profiler包將這些靶分子進行GO和KEGG富集分析，節(jié)點度值表示網(wǎng)絡中與節(jié)點相連邊的數(shù)量，節(jié)點大小與其度值成正比；中介中心度主要表示網(wǎng)絡中最短路徑經(jīng)過該節(jié)點的數(shù)量占路徑總和的比例，反映該節(jié)點對整個網(wǎng)絡的作用及影響力。各節(jié)點對應的參數(shù)值越大，則提示其在網(wǎng)絡中的樞紐作用越重要[10]。采用差異基因中與該項目相關的基因數(shù)和矯正后的P值對該網(wǎng)絡進行統(tǒng)計學分析，對各節(jié)點的重要性進行評估，以評價鴉膽子活性成分、靶標蛋白的重要程度。

2 結果

2.1 鴉膽子活性成分篩選結果和活性成分-靶標蛋白網(wǎng)絡構建 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出鴉膽子潛在的活性成分(見表1)：鴉膽苦素C、鴉膽子苦醇、β-谷甾醇、鴉膽苷(B、C_qt、D、H、I、J、L、M、P)、鴉膽苦苷(A_qt、B)、木犀草素。根據(jù)DrugBank獲取活性成分的潛在靶點：毒蕈堿乙酰膽堿受體(M1、M3、M5)、δ型阿片受體、5-羥色胺2A受體、α-1A腎上腺素能受體、μ型阿片受體、半胱胺酸蛋白酶-3、前列腺素G/H合酶1和2(PTGS1、PTGS2)、孕酮受體、一氧化氮合酶、胰島素-1、肝細胞生長因子受體、熱休克蛋白HSP90、1型非受體蛋白酪氨酸磷酸酶、DNA拓撲異構酶Ⅱ等，從而構建鴉膽子的活性成分-靶標蛋白網(wǎng)絡(見表2)。利用String數(shù)據(jù)庫，獲取活性成分的靶蛋白：轉錄因子JUN、轉錄因子RELA、抑癌基因TP53、蛋白激酶B1(protein kinase B1，PKB1/Akt1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等77種靶蛋白(見表3)。置信度設定為0.9，節(jié)點大小代表度值，構建這些靶蛋白的PPI網(wǎng)絡，靶蛋白及其涉及腫瘤相關通路之間有著不同程度的關聯(lián)和重疊部分，其中JUN、RELA、TP53、AKT1、MAPK1、VEGF等節(jié)點值和度值相對較高(見圖1)。

表1 鴉膽子活性成分

2.2 GO分析和KEGG靶點通路分析 利用R語言Cluster profiler包將這些靶蛋白進行GO分析(細胞組分、分子功能、生物學過程)和KEGG靶點通路分析。通過GO分析，獲取細胞組分、分子功能、生物學過程的富集條目，預測靶點的功能分布，大部分與腫瘤相關。靶點在細胞組分中，膜脂筏、膜微區(qū)、膜區(qū)較重要；在分子功能中，蛋白質異源二聚反應活性、神經(jīng)遞質受體活性、泛素類-蛋白連接酶結合作用突出；在生物學過程中，細胞對藥物的反應和對抗生素反應所占比例較大。

通過KEGG靶點通路分析結果可知，鴉膽子主要通過JUN、RELA、TP53、B1(PKB1/AKT1)、TNF、APP、MAPK、VEGF等相關通路發(fā)揮作用。其中節(jié)點度值最高的基因JUN定義為核心基因，通過TCGA分析其在多種腫瘤的作用，其在乳腺癌、肺腺癌、肺鱗癌和卵巢癌中均呈現(xiàn)出在腫瘤組織表達高于正常組織(見圖2)。結果表明JUN在腫瘤組織的活性高于正常組織，提示其低表達對機體具有保護作用。

表2 鴉膽子活性成分相關靶點

表3 鴉膽子活性成分-靶蛋白網(wǎng)絡關鍵節(jié)點及其度值

3 討論

中藥活性的體現(xiàn)往往通過多成分-多靶點-多通路發(fā)揮作用。本研究構建的鴉膽子活性成分-靶蛋白通路中，TNF-α信號通路通過TNF和腫瘤壞死因子受體1結合而激活，激活的TNF-α信號通路可導致核轉錄因子κB核易位和c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38蛋白、JUN活化，促進促炎細胞因子、趨化因子、生長因子和TNF-α等的表達[11-13]。MAPK通路包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK，這3種激酶能依次激活，共同調節(jié)著細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理/病理過程。VEGF在內皮細胞的增殖和遷移中起著重要的作用，為生長中的腫瘤提供營養(yǎng)，使腫瘤細胞與宿主血管建立連續(xù)性，有研究表明VEGF高表達的卵巢癌患者預后差[14]。鴉膽子主要通過轉錄JUN、TNF、MAPK、AKT等相關因子和靶蛋白參與其相關通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，表明基于網(wǎng)絡藥理學對鴉膽子的通路預測和靶點篩選具有一定的準確性。

圖1 鴉膽子活性成分-靶蛋白網(wǎng)絡

圖2 TCGA分析JUN在乳腺癌、肺腺癌、肺鱗癌和卵巢癌中的作用

本研究構建了鴉膽子“多成分-多靶點-多通路”的網(wǎng)絡圖，其中包括15種活性成分、158種靶點以及相關成分-靶標蛋白網(wǎng)絡。鴉膽苷、鴉膽苦苷等是其主要抗腫瘤成分，根據(jù)細胞組分、分子功能、生物學過程的富集條目預測靶點的功能分布，大部分與腫瘤相關。同時鴉膽子在多種腫瘤中可能通過TNF、MAPK、VEGF、PI3K/Akt等信號通路參與抗炎、抗腫瘤等。鴉膽子轉錄核心基因JUN，其在腫瘤組織的活性高于正常組織，提示其低表達對機體具有保護作用。本分析結果可能為今后研究鴉膽子抗腫瘤機制提供新依據(jù)和新思路。