劉 軍,鄭曉芬,周麗娟,周海燕,楊海燕,曹建軍

(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,運(yùn)城 044600;*通訊作者,E-mail:caojianjun@yabaoyaoye.com)

丁桂兒臍貼為亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司的獨(dú)家品種,由丁香、肉桂、蓽茇三味藥組成,具有健脾溫中,散寒止瀉的作用。適用于小兒泄瀉、腹痛的輔助治療[1-3]。丁桂兒臍貼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中主要是對有效成分丁香酚進(jìn)行控制來保證產(chǎn)品的質(zhì)量[4,5],但是中藥質(zhì)量控制的方法只對其中少數(shù)已知成分進(jìn)行分析,無法體現(xiàn)中醫(yī)藥的整體性特點(diǎn),因此,為了更好地控制中藥制劑的質(zhì)量,必須發(fā)展中藥質(zhì)量控制的新方法,建立現(xiàn)代質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的新體系。中藥指紋圖譜可以分析中藥中有效成分和無效成分的種類和其量分布的信息,符合中醫(yī)藥整體性和模糊性的特點(diǎn),是中藥制劑質(zhì)量控制的重要手段,可較全面地反映原料藥材、制劑工藝全過程及成品的質(zhì)量,已成為現(xiàn)代中藥制劑質(zhì)控的重要方法[6,7]。本研究通過對丁桂兒臍貼的HPLC指紋控制方法進(jìn)行探究,旨在建立丁桂兒臍貼的HPLC質(zhì)量控制新方法,同時(shí)為過程控制提供新方法,更全面控制丁桂兒臍貼的產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司),Agilent 1260高效液相色譜儀;XP205電子天平(梅特勒托利多國際股份有限公司),超聲波清洗器(KQ-500DE,昆山市超聲儀器有限公司)。

丁香酚(批號:110725-201414),桂皮醛(批號:110710-201619),胡椒堿(批號:110775-201405),所有對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院,丁桂兒臍貼(批號:1711503A,151226、1609501A、1701209A、1703201A、1706201A、1709205A、1709510A、1709211B、1709212B、1709212A,1711214A,1711215A),乙腈(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司,批號:175157),甲醇(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司,批號:160728),甲酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 取本品,剪碎,混勻。取1 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,稱定重量,加熱回流1 h,取出,放至室溫,再稱定重量,用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.2.2 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18 250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長254 nm;柱溫30 ℃;流速1.0 ml/min;以甲醇為流動相A,0.2%甲酸溶液為流動相B,梯度洗脫(0-15 min,8%-25%A;15-25 min,25%-40%;25-50 min,40%-70%;50-90 min,70%-90%A),以桂皮醛的色譜峰為S峰,理論板數(shù)以桂皮醛峰計(jì)應(yīng)不低于10 000。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 專屬性 按處方輔料比例,按制備工藝制成陰性對照制劑,再按供試品溶液制備方法制備成陰性對照液。按1.2.2項(xiàng)下色譜條件分析,記錄色譜圖。

1.2.3.2 精密度 取丁桂兒臍貼,按1.2.1項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,按1.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次,序號依次為1-6,以6號峰桂皮醛作為參照物,計(jì)算各主要色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。

1.2.3.3 重復(fù)性 取同一批次丁桂兒臍貼6份,序號依次為1-6,按1.2.1項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,按1.2.2項(xiàng)下色譜條件檢測,以6號峰桂皮醛作為參照物,計(jì)算各主要色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。

1.2.3.4 穩(wěn)定性 取丁桂兒臍貼樣品,按1.2.1項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液,按1.2.2項(xiàng)下色譜條件分別于0,2,4,8,12,18,24,32,40,48 h進(jìn)樣檢測,以桂皮醛作為參照物,計(jì)算各主要色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。

1.2.3.5 耐用性 使用不同型號的儀器(Agilent 1260、Agilent 1200、島津LC-20AT)、不同批次(序列號:USCL 060354、USCL 059648、USCL 058060、USCL 036549)的色譜柱對同一批次丁桂兒臍貼進(jìn)行檢測,選用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012版本)計(jì)算其相似度。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性 結(jié)果顯示輔料對樣品檢測無影響,能夠保證指紋圖譜檢測過程中的專屬性(見圖1)。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 結(jié)果顯示12個(gè)色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積穩(wěn)定(見圖2,表1,2),RSD均小于3%,表明該儀器的精密度良好。

圖1 專屬性圖譜Figure 1 Specificity of fingerprints

圖2 丁桂兒臍貼精密度試驗(yàn)12個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積對比圖Figure 2 The precision results of relative retention time and peak area of 12 common peaks of Ding Gui Er Qi Tie

表1 丁桂兒臍貼指紋圖譜保留時(shí)間的精密度結(jié)果(min)

Table 1 The results of precision of retention time of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie(min)

峰號第1次第2次第3次第4次第5次第6次RSD(%)10.17750.17730.17690.17750.17670.17720.1920.50310.50290.50230.50270.50190.50250.0930.53940.53900.53860.53880.53830.53860.0840.81450.81360.81400.81410.81390.81340.0550.86170.86150.86160.86180.86170.86120.0361.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0071.25181.25191.25131.25211.25131.25160.0381.48781.48671.48511.48551.48351.48500.1191.64931.64831.64591.64551.64341.64520.14101.73031.72931.72701.72521.72321.72400.17111.92381.92281.91881.91161.90781.90920.37122.17662.17642.16832.15372.14812.14970.62

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果12個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積穩(wěn)定,RSD均小于1%,表明該方法重復(fù)性良好(見表3,4)。

表2 丁桂兒臍貼指紋圖譜峰面積的精密度結(jié)果

Table 2 The results of precision of peak area of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

峰號第1次第2次第3次第4次第5次第6次RSD(%)10.42360.42400.42770.42820.42980.43000.6620.80040.80240.80390.80550.80860.80730.3930.51620.51820.51950.51950.52140.51470.4840.29660.29220.29380.29400.29580.29670.6252.35612.36562.36862.38972.40132.40160.8361.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0070.59360.58830.59150.59140.59780.59600.5980.64800.64850.65240.65320.65520.65480.4890.10310.10430.10490.10440.10460.10410.60100.07850.07850.07870.07800.07890.07790.50110.20250.21240.21050.20030.20070.19992.73120.17790.17850.17860.17780.17820.17850.20

表3 丁桂兒臍貼指紋圖譜相對保留時(shí)間的重復(fù)性結(jié)果(min)

Table 3 The results of repeatability of retention time of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie(min)

峰號1號2號3號4號5號6號RSD(%)10.17750.17760.17770.17720.17700.17700.1820.50310.50330.50290.50270.50270.50270.0630.53940.53950.53910.53900.53880.53890.0640.81400.81380.81370.81380.81370.81390.0250.86170.86150.86150.86140.86140.86160.0261.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0071.25151.25181.25221.25201.25211.25220.0381.48651.48691.48591.48591.48581.48620.0391.64621.64671.64551.64671.64671.64750.05101.72341.72431.72411.72641.72641.72710.09111.89971.90121.91371.91321.91141.91530.36122.12522.12792.15612.15512.15132.16000.72

表4 丁桂兒臍貼指紋圖譜峰面積的重復(fù)性結(jié)果

Table 4 The results of repeatability of peak area of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

峰號1號2號3號4號5號6號RSD(%)10.43570.44250.44510.42440.44040.46052.6920.80790.82520.82690.79410.82700.85082.3630.51730.52960.52690.51370.52910.54221.9340.29510.30270.30410.29400.30270.30981.9752.39822.41102.46072.37262.48082.39791.7261.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0070.59250.59160.59720.59150.59780.60340.7980.66070.66820.66890.64900.66960.67701.4590.10440.10540.10550.10310.10640.10731.41100.07530.07620.07760.07810.08020.08032.62110.19590.19900.20070.19950.20590.20211.68120.17170.17550.17830.18110.18580.18362.93

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果顯示12個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間穩(wěn)定,RSD均小于1%,相對峰面積相對恒定,RSD均小于3%(見表5,6);表明本品的供試品溶液至少在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 丁桂兒臍貼指紋圖譜保留時(shí)間穩(wěn)定性結(jié)果(min)

Table 5 The results of stability of retention time of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie(min)

峰號0 h2 h4 h8 h12 h18 h24 h32 h40 h48 hRSD(%)10.17740.17640.17720.17610.17640.17520.17600.17610.17860.17580.5520.50250.50040.50290.50050.50050.50030.50070.50150.50130.50030.1930.53870.53670.53940.53660.53670.53680.53710.53760.53740.53660.1940.81390.81330.81570.81510.81460.81410.81420.81460.81480.81410.0950.86170.86120.86450.86310.86250.86160.86180.86220.86270.86220.1161.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0071.25151.24951.25321.25201.25131.25211.25201.25181.25131.25180.0881.48441.48281.48851.48661.48461.48631.48661.48691.48491.48580.1191.64511.64301.65061.64601.64501.64681.64701.64721.64601.64700.12101.72491.72301.73131.72661.72411.72611.72571.72621.72671.72760.13111.90931.90771.91951.91511.90501.90761.90261.90371.91341.90940.28122.14742.14522.16562.14572.13912.14062.13102.13122.15452.15050.49

表6 丁桂兒臍貼指紋圖譜峰面積的穩(wěn)定性結(jié)果

Table 6 The results of stability of peak area of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

峰號0 h2 h4 h8 h12 h18 h24 h32 h40 h48 hRSD(%)10.43510.43830.44190.43850.44000.42460.44570.45070.45030.45361.9620.81750.81210.82170.82460.82760.83500.84180.85000.85130.85191.7830.52750.52920.53930.53600.53720.55150.54860.54600.58260.55772.9740.30020.29740.30700.30330.30490.30060.30450.30820.31190.30891.4752.41432.41902.43482.45342.45022.45982.46432.49222.52372.50991.4961.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0070.59030.58930.60550.59510.59090.59490.59660.60350.60050.60100.9680.66270.66340.66900.66600.66740.67130.67230.68070.68410.68251.1890.10520.10550.10940.10630.10640.11040.11090.11180.11260.11182.65100.07880.07880.07960.08060.07940.07910.07890.07990.08210.08141.45110.20150.20200.20410.20340.20270.20400.20360.20620.21220.20431.49120.18170.18150.18400.18180.18150.18290.18400.18580.18750.18691.25

2.1.5 耐用性研究 不同型號儀器間測定結(jié)果大致相同,指紋圖譜相似度均大于0.98,說明高效液相色譜儀的型號對本指紋圖譜方法影響不大,儀器耐用性良好。

按擬定的指紋圖譜測定方法,使用不同批次色譜柱對同一批次丁桂兒臍貼進(jìn)行檢測,以其中任一批次色譜柱圖譜為參照,計(jì)算相似度,結(jié)果表明不同批次色譜柱間測定結(jié)果大致相同,指紋圖譜相似度均大于0.99,色譜柱耐用性良好(見表7)。

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 丁桂兒臍貼對照圖譜建立 對亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的批號為151226、1609501A、1701209A、1703201A、1706201A、1709205A、1709510A、1709211B、1709212B、1709212A的丁桂兒臍貼,共計(jì)10批次樣品,分別按上述建立的指紋圖譜測定方法進(jìn)行檢測,采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012版本)擬合生成對照指紋圖譜,對照峰為桂皮醛色譜峰(見圖3)。

表7 丁桂兒臍貼指紋圖譜耐用性結(jié)果

Table 7 The results of robustness of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

條件 相似度儀器型號 Agilent 12601.000 Agilent 12000.999 島津LC-20AT0.987色譜柱序列號 USCL 0603541.000 USCL 0596480.997 USCL 0580600.998 USCL 0365490.999

6號峰為對照峰;其余色譜峰未進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定圖3 丁桂兒臍貼對照指紋圖譜Figure 3 Control fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

2.2.2 丁桂兒臍貼指紋圖譜相似度評價(jià) 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012.0版本)對比亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的批號為1711214A、1711215A、1711503A的丁桂兒臍貼指紋圖譜相似度,結(jié)果顯示，3批丁桂兒臍貼相似度與對照指紋圖譜比較均>0.990(見表8,圖4)。

表8 丁桂兒臍貼3批次指紋圖譜檢測結(jié)果

Table 8 Similarity evaluation of chromatogram of 3 batches of Ding Gui Er Qi Tie samples

樣品批號相似度丁桂兒臍貼1711214A0.9911711215A0.9901711503A0.990

3 討論

2000年國家藥品監(jiān)督管理部門首先提出建立中藥注射劑指紋圖譜及相關(guān)質(zhì)控要求,在注射劑指紋圖譜基礎(chǔ)上,已逐步開展對中藥材、半成品、成品制劑的指紋圖譜研究[8-10]。中藥制劑由多味中藥加工而成,化學(xué)成分復(fù)雜,其療效非任何一個(gè)活性成分可代表,亦不是多個(gè)化學(xué)成分藥用作用的簡單相加,指紋圖譜技術(shù)可對中藥制劑進(jìn)行整體性評價(jià),對制劑質(zhì)量控制具針對性和合理性[11,12]。

丁桂兒臍貼為亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司的獨(dú)家品種,雖然對進(jìn)廠藥材和中間過程進(jìn)行了很好的控制,包括了全自動的提取和制劑生產(chǎn)過程,但是近年來藥材本身帶來的差異對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生很大的影響,為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量,本研究通過對供試品制備和色譜條件的方法學(xué)考察及方法學(xué)驗(yàn)證,建立了丁桂兒臍貼的HPLC指紋圖譜測定方法,為其質(zhì)量評價(jià)提供了新的方法。本研究的局限性在于僅對丁桂兒臍貼制劑的HPLC方法進(jìn)行了考察,未對生產(chǎn)過程的變化情況進(jìn)行分析,因此后續(xù)的研究還需關(guān)注藥材-中間過程-制劑的指紋圖譜的變化情況。

圖4 不同批號的指紋圖譜檢測結(jié)果Figure 4 Similarities fingerprints of different batch number