沈耀川,鄭 歆,余巧龍,陳 昕

(中國(guó)人民解放軍第一七四醫(yī)院口腔科,廈門 361000;*通訊作者,E-mail:dentistchenxin@163.com)

舌鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,也是最常見的口腔癌,約占口腔癌的1/3-1/2[1,2]。近年來舌癌的發(fā)病率越來越高,人們對(duì)其關(guān)注度也隨之增加。舌癌對(duì)患者生存率及面容、口腔頜面部功能等影響均較大。目前以手術(shù)、化療和放療等為主的傳統(tǒng)治療方法未能取得令人滿意的療效[3-5]。舌癌組織中的血管密度可能影響其生長(zhǎng)速度及預(yù)后。NRP-1最早是作為神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向調(diào)節(jié)因子受體被發(fā)現(xiàn),是一類在脊椎動(dòng)物中高度保守的分子量為130-140 kDa的糖蛋白[6-8]。近年來大量研究結(jié)果顯示,人類的許多腫瘤組織上都有NRP-1的表達(dá),包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌,而在相應(yīng)的正常組織中幾乎不表達(dá)[9-11]。NRP-1作為血管生長(zhǎng)因子的共受體,在腫瘤血管新生方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。NRP-1在對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有重要作用。目前,已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,舌癌組織中有NRP-1的高表達(dá)[12,13],但尚沒有NRP-1對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)特性影響的相關(guān)基礎(chǔ)研究。本研究旨在初步探討NRP-1在舌鱗狀細(xì)胞癌TCa8113細(xì)胞的表達(dá)及其對(duì)TCa8113細(xì)胞增殖遷移等生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液(Gibco);LB培養(yǎng)基(Solarbio);阿霉素(北京中碩科技有限公司);胎牛血清FBS(Gibco);Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific);全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar-全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀);Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室(Corning);高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific);生物顯微鏡(EVOS);NRP-1抗體(2 mg/ml,GeneTex)。

1.2 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)

TCa8113細(xì)胞野生型細(xì)胞(WT-TCa8113)和NRP-1敲低TCa8113細(xì)胞(NRP-1KD-TCa8113)購(gòu)自上海豐暉生物科技有限公司。用含10% FBS和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液,于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 NRP-1單克隆抗體與NRP-1結(jié)合能力的鑒定

首先,利用Western blot檢測(cè)WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細(xì)胞中NRP-1的表達(dá)情況。接著使用共聚焦顯微鏡檢測(cè)NRP-1抗體與T-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細(xì)胞的結(jié)合能力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WT-TCa8113細(xì)胞和NRP-1KD-TCa8113細(xì)胞,蛋白酶消化后,PBS稀釋成單細(xì)胞懸液并加入到含有細(xì)胞爬片的6孔板中,制備細(xì)胞爬片。待細(xì)胞爬片制備完成后,加入熒光素BRITC標(biāo)記的NRP-1抗體與細(xì)胞共同孵育30 min。孵育后,除去培養(yǎng)液,PBS輕輕洗滌3次以除去游離和非特異性結(jié)合的抗體。共聚焦熒光顯微鏡下觀察NRP-1單克隆抗體在WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細(xì)胞中的結(jié)合情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共設(shè)置2個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分三組。PBS組(陰性對(duì)照組)采用WT-TCa8113細(xì)胞系,加100 μl PBS處理;NRP-1 antibody組采用WT-TCa8113細(xì)胞系,加100 μl NRP-1單克隆抗體處理;NRP-1 knockdown組采用NRP-1KD-TCa8113細(xì)胞系,加100 μl PBS處理。即本研究通過構(gòu)建NRP-1敲低TCa8113細(xì)胞系和使用NRP-1單克隆抗體兩種方法抑制TCa8113細(xì)胞的NRP-1功能,再通過比較兩種方法抑制NRP-1功能后,對(duì)WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細(xì)胞12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖、遷移、凋亡及對(duì)化療藥物敏感性的影響。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細(xì)胞分別稀釋成2×105/ml。按1.4的分組將兩株組細(xì)胞分成6組并接種到12孔板,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)細(xì)胞數(shù)量,每次測(cè)量前均使用胰蛋白酶進(jìn)行消化并用槍頭吹打混勻。

1.6 Transwell檢測(cè)抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

按1.4的分組將WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株組細(xì)胞細(xì)胞稀釋成2×105/ml,并分成6組,分別取100 μl加入transwell上腔,下腔放入600 μl含有0.5% BSA的DMEM培養(yǎng)液。于37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng),分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集下腔的細(xì)胞做細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細(xì)胞稀釋成10×104/ml,轉(zhuǎn)移至6孔板中培養(yǎng)。按1.4的分組將上述兩株組細(xì)胞分成6組并做相應(yīng)處理,于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞并用500 μl binding buffer重懸細(xì)胞后,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI染色液,混勻后室溫孵育15 min。孵育完畢收集細(xì)胞用預(yù)冷500 μl PBS重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè),計(jì)算總細(xì)胞量和凋亡細(xì)胞量。

1.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞化療藥物敏感性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細(xì)胞按1.4的分組將兩株組細(xì)胞分成6組并做相應(yīng)處理。用含有不同濃度的表阿霉素(EPI)的培養(yǎng)基稀釋成2×105/ml,每組細(xì)胞的EPI終濃度分別為0.001,0.01,0.1,0.2,0.5,1 μg/ml。于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。分別計(jì)算各組細(xì)胞在不同濃度EPI處理下的細(xì)胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NRP-1敲低細(xì)胞株及NRP-1抗體結(jié)合能力的鑒定

Western blot結(jié)果顯示,野生型細(xì)胞WT-TCa8113組在130 kDa附近出現(xiàn)一明顯特異性條帶,與NRP-1理論分子量復(fù)合。而NRP-1敲低組NRP-1KD-TCa8113組的NRP-1蛋白表達(dá)量較野生型細(xì)胞明顯降低。結(jié)果表明,成功構(gòu)建NRP-1敲低的TCa8113細(xì)胞株,且敲低效率較明顯(見圖1)。

共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,在WT-TCa8113組中,可見明顯紅色熒光在細(xì)胞表面集聚,而NRP-1KD-TCa8113組則沒有(見圖2)。結(jié)果表明,NRP-1抗體可在活體細(xì)胞中與TCa8113細(xì)胞膜上的NRP-1結(jié)合。

圖1 Western blot檢測(cè)WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細(xì)胞株NRP-1蛋白表達(dá)量Figure 1 Western blot analysis of NRP-1 expression in WT-TCa8113 and NRP-1KD-TCa8113 cell lines

圖2 共聚焦顯微鏡分析NRP-1抗體與TCa8113細(xì)胞膜表面的NRP-1的結(jié)合能力Figure 2 Confocal microscopy analysis of the binding ability of NRP-1 antibody to TCa8113 cells

2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞增殖的影響

以PBS組作為陰性對(duì)照,分別比較NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組培養(yǎng)12 h和24 h后的細(xì)胞數(shù),評(píng)估兩者抑制NRP-1功能后對(duì)TCa8113細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果見表1。在0 h時(shí),三組細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.716)，均約為2×105/ml。而培養(yǎng)12 h后,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的細(xì)胞數(shù)開始較PBS組少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)24 h后,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的細(xì)胞數(shù)與PBS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組抑制NRP-1功能后,能夠抑制TCa8113細(xì)胞增殖,因此可推測(cè),NRP-1具有促進(jìn)TCa8113細(xì)胞增殖的作用。

此外,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組對(duì)比,在12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),NRP-1 knockdown組的細(xì)胞數(shù)均小于NRP-1 antibody組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示通過shRNA方法構(gòu)建NRP-1低表達(dá)細(xì)胞株對(duì)NRP-1功能抑制可能更徹底,故對(duì)細(xì)胞抑制作用更明顯。

表1 抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞增殖的影響(×105/ml)

Table 1 Effect of NRP-1 function inhibition on cell proliferation(×105/ml)

分組0 h12 h24 hPBS組2.03±0.183.79±0.355.93±0.44NRP-1 antibody組2.14±0.222.96±0.48?3.71±0.57??NRP-1 knockdown組2.18±0.272.41±0.22?#2.66±0.29??#

與PBS組比較,*P<0.05,**P<0.01;與NRP-1 antibody組比較,#P<0.05

2.3 Transwell檢測(cè)抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

用Transwell檢測(cè)NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細(xì)胞的遷移能力,結(jié)果見圖3。NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組的細(xì)胞遷移能力在12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)下室細(xì)胞量與相應(yīng)時(shí)間段的PBS陰性對(duì)照組有顯著差異。12 h時(shí),PBS組,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組下室細(xì)胞量分別為428±56,235±43和197±27個(gè)。方差分析三組間均數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細(xì)胞數(shù)比PBS組少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

與PBS組比較，**P<0.01圖3 NRP-1抗體和NRP-1敲低對(duì)細(xì)胞遷移的影響 (n=3)Figure 3 Effect of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on cell migration (n=3)

在24 h時(shí),PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組下室細(xì)胞量分別為587±61,398±42和244±37個(gè)。方差分析三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。其中PBS組細(xì)胞數(shù)比NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明,用NRP-1 antibody和NRP-1 shRNA抑制NRP-1功能后,能夠抑制TCa8113細(xì)胞遷移能力。

此外,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組對(duì)比,在12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組的細(xì)胞凋亡情況見圖4。12 h時(shí)PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細(xì)胞凋亡率分別為(8.2±1.5)%,(14.9±2.4)%和(24.2±5.8)%,方差分析三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組比PBS組細(xì)胞凋亡率低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

與PBS組比較，**P<0.01圖4 NRP-1抗體和NRP-1敲低對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 (n=3)Figure 4 Effect of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on apoptosis (n=3)

24 h時(shí)PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細(xì)胞凋亡率分別為(10.0±3.7)%,(20.9±3.8)%和(35.4±6.3)%,方差分析三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組比PBS組細(xì)胞凋亡率低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

此外,NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組12 h時(shí)凋亡率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.082);24 h時(shí)兩組凋亡率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.086)。

2.5 抑制NRP-1功能對(duì)細(xì)胞耐藥的影響

細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性一定程度可以反映細(xì)胞的耐藥程度,本實(shí)驗(yàn)通過各組細(xì)胞的半數(shù)凋亡率的化療藥物濃度來評(píng)估NRP-1對(duì)細(xì)胞耐藥的影響,利用IC50Calculator計(jì)算軟件計(jì)算各組的IC50,結(jié)果見圖5。藥物培養(yǎng)12 h,PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的半數(shù)凋亡率的化療藥物濃度分別為(0.48±0.14)μg/ml,(0.19±0.06)μg/ml和(0.11±0.03)μg/ml,NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組與PBS組對(duì)比,P值分別為0.016和0.006,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組對(duì)比,兩者半數(shù)凋亡濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.107)。

藥物培養(yǎng)24 h,PBS組、NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組的半數(shù)凋亡率的化療藥物濃度分別為(0.23±0.08)μg/ml,(0.12±0.04)μg/ml和(0.06±0.02)μg/ml,NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組與PBS組對(duì)比,P值分別為0.035和0.007。結(jié)果表明兩種方法抑制NRP-1功能均能增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,使細(xì)胞凋亡率增加。NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組對(duì)比,兩者半數(shù)凋亡濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.081)。

圖5 不同處理組處理12 h和24 h后的細(xì)胞凋亡率 (n=3)Figure 5 Apoptosis rate after treatment for 12 h and 24 h in different treatment groups (n=3)

3 討論

口腔頜面部惡性腫瘤的發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第六位,而其中至少有80%是鱗狀細(xì)胞癌[14]。口腔舌鱗狀細(xì)胞癌惡性程度較高,且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差,術(shù)后常繼發(fā)畸形,對(duì)患者生活質(zhì)量造成極大影響[15,16]。而傳統(tǒng)放化療對(duì)舌癌效果不佳,故研究新的治療方式尤為重要。惡性腫瘤的快速生長(zhǎng),需要大量血管為其提供豐富的營(yíng)養(yǎng),通過抑制腫瘤內(nèi)血管生成,從而抑制腫瘤生長(zhǎng),是治療舌癌的重要思路之一[17]。而NRP-1具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu),其作為Sema3A和VEGF165等細(xì)胞因子的多功能受體,并受多種miRNA分子的負(fù)向調(diào)控,在神經(jīng)發(fā)育、血管生成、腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著重要作用,特別是其在腫瘤血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移方面中的作用[18-20]。NRP-1有可能成為未來口腔癌靶向治療的新靶點(diǎn)、新方向。

目前已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),NRP-1在人舌癌組織及細(xì)胞系TCa8113中呈高表達(dá),提示可能和舌癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12,21]。但是目前仍沒有NRP-1對(duì)人舌癌組織及細(xì)胞系TCa8113細(xì)胞生物學(xué)功能的相關(guān)基礎(chǔ)研究,NRP-1對(duì)舌癌TCa8113細(xì)胞生物學(xué)特性的影響尚不清楚。本研究以舌癌TCa8113細(xì)胞為研究對(duì)象,采用敲低NRP-1或NRP-1抗體兩種方法抑制TCa8113細(xì)胞NRP-1的功能,與野生型細(xì)胞比較,從而探討NRP-1對(duì)TCa8113細(xì)胞的生物學(xué)特征的影響。本實(shí)驗(yàn)中,使用兩種方法抑制NRP-1功能后,TCa8113細(xì)胞的增殖能力均顯著降低,而凋亡率則顯著增加,說明NRP-1對(duì)TCa8113的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用。在抑制NRP-1功能后,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,細(xì)胞發(fā)生凋亡,且多集中在早期凋亡。該結(jié)果與NRP-1在其他腫瘤中的作用相同。唐子春等[22]利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),特異性抑制NRP-1基因在人舌鱗狀細(xì)胞株SCC25中的表達(dá),結(jié)果提示NRP-1基因沉默可顯著降低腫瘤細(xì)胞的體外遷徙能力。本研究在TCa8113細(xì)胞中也得到相同結(jié)果。

舌癌的原發(fā)或繼發(fā)耐藥是導(dǎo)致療效差及復(fù)發(fā)率與死亡率高的重要原因[23]。近年來,探究舌癌的耐藥機(jī)制、如何克服或逆轉(zhuǎn)耐藥成為口腔舌癌治療的研究熱點(diǎn)。目前有研究報(bào)道,NRP-1可能與各類腫瘤的耐藥相關(guān)[24-26]。在本研究中,兩種方法抑制NRP-1功能后,細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯增加,NRP-1或可成為逆轉(zhuǎn)舌癌耐藥的一個(gè)重要靶點(diǎn)?；蚩赏ㄟ^NRP-1單克隆抗體抑制NRP-1功能,從而提高舌癌對(duì)化療藥物的敏感性。

本研究首次從細(xì)胞水平上探討NRP-1對(duì)口腔舌癌TCa8113細(xì)胞生物學(xué)特性的影響研究,但相關(guān)的機(jī)制仍未探究,后期仍需要更深入探究NRP-1影響TCa8113細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制。