樊晴伶,王景杰,竇維佳

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710038;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:weijia-dou@126.com)

腸道纖維化是克羅恩病(Crohn’s disease,CD)常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。研究顯示70%CD患者在病程中會(huì)發(fā)生纖維化并最終導(dǎo)致腸腔狹窄[1]。纖維化一旦發(fā)生,至少60%的患者在20年內(nèi)需要手術(shù)治療,然而術(shù)后狹窄亦有可能反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MF)是纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。腸道纖維化過程中,腸上皮細(xì)胞可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)轉(zhuǎn)換為MF[1,2],是MF的主要來源之一。EMT指上皮細(xì)胞失去其原有表型,獲得向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能。研究發(fā)現(xiàn)EMT參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、組織纖維化、瘢痕修復(fù)等病理生理過程[3,4],該過程受多種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)是EMT最有效的誘導(dǎo)因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)在CD合并纖維化中TGF-β1表達(dá)明顯升高[5]。因此,如何有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT是預(yù)防和治療腸道纖維化的關(guān)鍵。

Ano1即TMEM16A,是鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)成員之一,在維持正常生理功能方面有不可替代的重要作用[6]。近來大量研究發(fā)現(xiàn),Ano1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良密切相關(guān)[7]。在二硝基苯磺酸(DNBS)誘導(dǎo)腸道纖維化的大鼠模型中,腸道肌層中Ano1表達(dá)明顯升高,其表達(dá)水平與Collagen I和彈力蛋白呈正相關(guān)[8],提示Ano1可能參與腸道纖維化過程,但其具體機(jī)制仍不十分明確。

本研究通過TGF-β1刺激大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC6),觀察其細(xì)胞形態(tài)變化,并檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物及Ano1表達(dá)情況。利用過表達(dá)慢病毒感染IEC6,上調(diào)細(xì)胞中Ano1表達(dá)后,再次以TGF-β1刺激感染細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Ano1過表達(dá)慢病毒(由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成),M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司),胎牛血清FBS(美國(guó)Invitrogen公司),TGF-β1蛋白(英國(guó)Abcam公司),兔抗α-SMA單克隆抗體、兔抗vimentin單克隆抗體、小鼠抗E-cadherin單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司),小鼠抗Fibronectin單克隆抗體(美國(guó)R&D公司),兔抗Ano1多克隆抗體(美國(guó)Proteintech公司)、GAPDH抗體、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗(美國(guó)Santa Cruz公司),DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司),311型隔熱式CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific),5417R型低速低溫離心機(jī)(Eppendorf),XDS-100型倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司),IX71型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC6)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),DMEM+10%FBS于37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC6,制成濃度為1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,接種1 ml細(xì)胞懸液于12孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至20%融合時(shí),吸取上清,加入2 μl Ano1過表達(dá)慢病毒(2×10-8TU/ml),16 h后觀察細(xì)胞狀態(tài),替換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),構(gòu)建Ano1過表達(dá)IEC6細(xì)胞系(IEC6-Ano1),以空載體為陰性對(duì)照(IEC6-NC)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 明確TGF-β1對(duì)IEC6細(xì)胞EMT過程及Ano1表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)分為兩組:①control組(正常對(duì)照組):IEC6加入無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h;②TGF-β1組:IEC6加入無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜,第2天加入10 ng/ml TGF-β1培養(yǎng)72 h,倒置相差顯微鏡觀察不同組細(xì)胞形態(tài),并棄上清收細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步探討Ano1在TGF-β1誘導(dǎo)IEC6細(xì)胞EMT中的作用,實(shí)驗(yàn)分為三組:①control組(正常對(duì)照組):IEC6加入無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h;②IEC6-NC組:將IEC6-NC細(xì)胞加入無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h;③IEC6-Ano1+TGF-β1組:IEC6-Ano1細(xì)胞加入無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜,第2天加入10 ng/ml TGF-β1培養(yǎng)72 h,熒光顯微鏡觀察不同組細(xì)胞形態(tài),并棄上清收細(xì)胞,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 real time-PCR檢測(cè)Ano1 mRNA表達(dá)水平 使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度法定量,并統(tǒng)一各組RNA濃度。取2 μl總RNA,在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè),反應(yīng)條件:95 ℃,3 min變性,95 ℃ 12 s,62 ℃ 40 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt分析mRNA相對(duì)表達(dá)水平,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參,所有引物均由生工公司合成,Ano1及GAPDH引物序列如下。Ano1:上游5′-TCGAGGAAGAGGAGGTGAGTAG-3′,下游5′-GATGTTGGACCGCACAGATG-3′;GAPDH:上游5′-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′,下游5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Ano1、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin及α-SMA蛋白表達(dá)水平 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,PBS沖洗3次,加入100 μl細(xì)胞裂解液充分裂解,4 ℃、12 000g,離心15 min,取上清BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結(jié)果取15-20 μl蛋白樣品加于10% SDS-PAGE中。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h,分別加入抗Ano1(1 ∶500稀釋)、E-cadherin(1 ∶1 000稀釋)、Vimentin(1 ∶1 000稀釋)、Fibronectin(1 ∶500稀釋)及α-SMA(1 ∶1 000稀釋)抗體,4 ℃過夜。TBST洗膜4次,每次8 min,加入二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育2 h,TBST洗膜4次,每次8 min,ECL顯色,采集圖像后用Image J圖像軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),兩組間差異比較采用t檢驗(yàn),多組間差異比較采用單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)IEC6發(fā)生EMT

以10 ng/ml TGF-β1刺激IEC6,72 h后觀察發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比,IEC6形態(tài)發(fā)生明顯改變,由紡錘形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或多角形,且細(xì)胞極性消失(見圖1)。Western blot結(jié)果顯示，上皮相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低,而間質(zhì)相關(guān)分子標(biāo)志物vimentin、Fibronectin及α-SMA蛋白表達(dá)水平明細(xì)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖2),說明TGF-β1可誘導(dǎo)IEC6發(fā)生EMT。

2.2 TGF-β1抑制IEC6中Ano1表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示,與正常對(duì)照相比,TGF-β1刺激后IEC6中Ano1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05,見圖3)；Western blot結(jié)果證實(shí)Ano1蛋白表達(dá)水平亦顯著降低(P<0.05,見圖2),說明TGF-β1可抑制IEC6中Ano1的表達(dá)。

A.control組,×10;B.control組,×40;C.TGF-β1組,×10;D.TGF-β1組,×40圖1 TGF-β1刺激IEC6細(xì)胞形態(tài)變化Figure 1 Effect of TGF-β1 on IEC-6 morphology

2.3 TGF-β1對(duì)IEC6-Ano1細(xì)胞形態(tài)的影響

利用Ano1過表達(dá)慢病毒感染IEC6,上調(diào)Ano1表達(dá),以空載體質(zhì)粒為陰性對(duì)照組,觀察發(fā)現(xiàn)與control組相比,陰性對(duì)照組(IEC6-NC)細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,而以10 ng/ml TGF-β1刺激過表達(dá)Ano1的IEC6(IEC6-Ano1),細(xì)胞形態(tài)亦無明顯改變,僅個(gè)別細(xì)胞呈多角化趨勢(shì)(見圖4)。

與control比較,*P<0.05,**P<0.001圖2 TGF-β1刺激IEC6后EMT相關(guān)蛋白及Ano1的表達(dá)Figure 2 Expression level of EMT-related proteins and Ano1 in IEC6 cells stimulated by TGF-β1

與control組比較,**P<0.05圖3 TGF-β1刺激IEC6后72 h Ano1 mRNA的水平Figure 3 Expression level of Ano1 mRNA in IEC6 cells stimulated by TGF-β1 for 72 h

2.4 TGF-β1對(duì)IEC6-Ano1細(xì)胞EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的影響

以10 ng/ml TGF-β1刺激IEC6-Ano1細(xì)胞72 h后,Western blot結(jié)果顯示,E-cadherin、Vimentin、Fribronectin及α-SMA蛋白表達(dá)水平較control組及IEC6-NC組無明顯差異(見圖5),說明在IEC6中上調(diào)Ano1可抑制TGF-β1介導(dǎo)的EMT發(fā)生。

3 討論

腸道纖維化是克羅恩病常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚不十分明確。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,腸道反復(fù)慢性炎癥刺激可激活肌成纖維細(xì)胞,在腸道纖維化中起重要作用[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn),纖維化與局部炎癥的嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性[10]。纖維化一旦發(fā)生,即使腸道炎癥得到控制也無法預(yù)防或逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)展[11],因此,闡明腸道纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找可能的預(yù)防及治療方法,具有重要意義。

圖4 TGF-β1刺激IEC6-Ano1后細(xì)胞形態(tài)變化Figure 4 Effect of TGF-β1 on IEC6-Ano1 morphology

圖5 TGF-β1刺激IEC6-Ano1后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression level of EMT-related proteins in IEC6-Ano1 cells stimulated by TGF-β1

EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變,在EMT過程中,上皮細(xì)胞失去其原有細(xì)胞形態(tài)、E-cadherin等蛋白表達(dá)降低,獲得間質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)梭形或多角形形態(tài),且Vimentin、α-SMA等間質(zhì)蛋白表達(dá)增加。研究表明,EMT不僅參與胚胎生成、器官發(fā)育、組織再生和傷口愈合等過程[12],同時(shí)在腎臟、肺臟、腸道等多種器官及組織纖維化中發(fā)揮重要作用[3]。Scharl等[13]在克羅恩病患者腸道纖維化部位發(fā)現(xiàn),Fribronectin及α-SMA等EMT相關(guān)蛋白表達(dá)增加。Flier等[14]通過大鼠直腸內(nèi)注射三硝基苯磺酸溶液(TNBS)模擬克羅恩病腸道炎癥和纖維化過程,發(fā)現(xiàn)約1/3肌成纖維細(xì)胞來源于腸上皮細(xì)胞,提示EMT參與腸道纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)在TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸纖維化模型中,miR-200b可以抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞EMT過程,從而緩解腸道纖維化程度[15]。因此,抑制EMT的發(fā)生發(fā)展可作為治療腸道纖維化的潛在靶點(diǎn)之一。

TGF-β1是纖維化過程的重要調(diào)節(jié)因子。TGF-β1促使細(xì)胞外基質(zhì)沉積,成纖維細(xì)胞增生,抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解,在慢性腎病、肝臟、肺纖維化等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[16,17]。另有研究發(fā)現(xiàn)在CD合并纖維化組織中,TGF-β1表達(dá)顯著升高[5],提示TGF-β1亦可參與腸道纖維化過程。大量研究顯示TGF-β1通過上調(diào)MMP9、PDGF等細(xì)胞因子,激活RTK、Notch等信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞EMT過程,最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[18]。本研究我們利用TGF-β1刺激IEC6細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn),刺激后IEC6細(xì)胞形態(tài)發(fā)生間質(zhì)樣改變,上皮相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低,而間質(zhì)相關(guān)分子標(biāo)志物Vimentin、Fibronectin及α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示TGF-β1可誘導(dǎo)IEC6細(xì)胞發(fā)生EMT。

Ano1是一種跨膜蛋白,表達(dá)于分泌上皮、血管平滑肌細(xì)胞、ICC、感覺神經(jīng)元等多種正常組織及細(xì)胞,介導(dǎo)不同器官和組織的生理功能和生物學(xué)行為[19]。近年來研究發(fā)現(xiàn),Ano1在頭頸部鱗癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌和胃腸間質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),在增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等腫瘤惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[4,6]。另外,Gao等[20]在心梗誘發(fā)心臟纖維化小鼠模型中發(fā)現(xiàn),心臟成纖維細(xì)胞中Ano1表達(dá)升高,心內(nèi)注射過表達(dá)Ano1腺病毒繼續(xù)上調(diào)Ano1表達(dá),心臟纖維化程度卻有所緩解,同時(shí)發(fā)現(xiàn)Ano1可抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路。而Sun等[21]發(fā)現(xiàn)在囊性纖維化中,TGF-β可抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞T84中Ano1的表達(dá)。為了揭示Ano1在腸道纖維化中的作用,我們利用TGF-β1誘導(dǎo)IEC6發(fā)生EMT,發(fā)現(xiàn)TGF-β1可顯著抑制IEC6中Ano1的表達(dá),提示Ano1可能參與TGF-β1誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞EMT過程。進(jìn)一步研究中我們應(yīng)用慢病毒系統(tǒng)上調(diào)IEC6中Ano1表達(dá),再次給予TGF-β1刺激,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Ano1后IEC6的EMT過程被抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,且E-cadherin、Vimentin、Fribronectin、α-SMA蛋白表達(dá)水平無明顯變化。

綜上所述,我們的研究結(jié)果表明Ano1參與TGF-β1介導(dǎo)的IEC6細(xì)胞EMT過程,在IEC6細(xì)胞中上調(diào)Ano1表達(dá),可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。