王羅春 瞿愛(ài)東 樓麗廣

摘 要 目的：評(píng)估重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001的臨床前主要藥效學(xué)及與原研藥安維汀的生物類似性。方法：從體外作用機(jī)制及活性、體內(nèi)抑瘤作用、及對(duì)荷瘤小鼠PK/PD等方面進(jìn)行研究。結(jié)果：F0001明顯抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化；抑制HUVEC細(xì)胞增殖，IC50為123 ng/ml。F0001 5 mg/kg顯著抑制人結(jié)腸癌Ls-174t、肺癌NCI-H460和惡性膠質(zhì)瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)，抑瘤率分別為68%、68%和86%；與化療藥CPT-11合用對(duì)人結(jié)腸癌Ls-174t有抑瘤增效作用，抑瘤率提高到89%。F0001與安維汀體外作用機(jī)制及活性相當(dāng)、體內(nèi)抑瘤效果相當(dāng)，二者在人結(jié)腸癌Ls-174t荷瘤小鼠體內(nèi)PK/PD參數(shù)相似。結(jié)論：F0001與原研藥安維汀在主要藥效學(xué)方面高度類似。

關(guān)鍵詞 重組抗VEGF人源化單克隆抗體 安維汀 抑瘤率

中圖分類號(hào)：R965； R979.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）13-0055-06

Preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001*

WANG Luochun1**， QU Aidong2***， LOU Liguang3****（1. Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Shanghai Institute of Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200051， China； 3. Shanghai Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001 and its biological similarity to the original drug Avastin. Methods： F0001 was evaluated for its mechanism of action， antitumor activity in vitro and in vivo， and PK/PD in tumor-bearing nude mice. Results： F0001 could significantly inhibit VEGF-stimulated KDR and downstream factor ERK1/2 phosphorylation， and VEGF-stimulated HUVEC proliferation with IC50 of 123 ng/ml. F0001 at 5 mg/kg could significantly inhibit the growth of human colon cancer Ls-174t， lung cancer NCI-H460 and malignant glioma U-87MG tumors subcutaneously transplanted into nude mice with the tumor inhibition rate of 68%， 68% and 86%， respectively. Combination of F0001 with chemotherapy drug CPT-11 produced synergistic antitumor effect in Ls-174 xenografts with the tumor growth inhibition of 89%. Conclusion： The mechanism and activity of F0001 in vitro and in vivo are similar to Avastin and their PK/PD parameters are similar in human colon cancer Ls-174t tumor-bearing mice. The main preclinical pharmacology of F0001 is very similar to that of original drug Avastin.

KEy WORDS recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody； Avastin； tumor inhibition rate

安維?。ㄘ惙ブ閱慰棺⑸湟海?Avastin）是美國(guó)基因技術(shù)公司和羅氏制藥公司開(kāi)發(fā)的一種抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的人源化單克隆抗體藥物，與化療藥合用，用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、腦膠質(zhì)瘤、晚期子宮頸癌、鉑耐藥復(fù)發(fā)性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性Her2陰性乳腺癌等[1-2]；2010年2月也獲準(zhǔn)在我國(guó)上市，用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌[3]。因此，安維汀是一種廣譜性抗癌藥物，臨床價(jià)值巨大。但其價(jià)格高昂，極大地限制了在我國(guó)臨床使用的可及性。

復(fù)旦張江公司研制的重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001是安維汀的生物類似候選藥物。本研究從F0001的體外作用機(jī)制及活性、體內(nèi)對(duì)裸小鼠荷人結(jié)腸癌Ls-174t或肺癌NCI-H460或惡性膠質(zhì)瘤U-87MG的抑瘤活性、以及在荷瘤裸小鼠的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)（pharmacokinetics based on pharmacodynamic drug concentration，PK/PD）等方面[4-7]，研究了F0001的臨床前主要藥效學(xué)作用及其與原研藥安維汀的生物類似性，以便為本品臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥物

重組抗VEGF人源化單克隆抗體（簡(jiǎn)稱F0001）注射液（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司研制，批號(hào)20140701）；安維?。≧oche Pharma （Schweiz） Ltd.，批號(hào)H0125B03、 H0132B04，使用前將供試藥用培養(yǎng)液或含0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度，置2～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?；鹽酸伊立替康（CPT-11）（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)616130304，使用時(shí)用生理鹽水配制。

1.2 試劑、儀器及細(xì)胞株

胎牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone公司；培養(yǎng)基M199/RPMI 1640購(gòu)自Gibco BRL公司；VEGF165購(gòu)自R&D Systems公司；phospho-ERK1/2 antibody及ERK1/2 antibody購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；b-tubulin antibody購(gòu)自Sigma公司；抗兔IgG二抗，抗小鼠IgG二抗購(gòu)自Calbiochem公司；PVDF膜及ECL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore公司；磺酰羅丹明B（SRB）購(gòu)自Sigma公司；Synergy H4多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司。

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）（美國(guó)ATCC，用含20 mg/ml ECGS、20% FBS的M199培養(yǎng)2～6代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）；人結(jié)腸癌Ls-174t細(xì)胞株/肺癌NCI-H460細(xì)胞株/惡性膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞株均購(gòu)自美國(guó)ATCC，均用含有青霉素、鏈霉素、及10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/cA裸小鼠，雌性，6～7周，分別購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司，合格證號(hào)2013001801920、2013001804063；上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)2007000572618、2007000571898、2007000-573259。

1.4 試驗(yàn)方法

1）對(duì)VEGF刺激的VEGFR2/KDR信號(hào)作用（Western blot法）[4，8] HUVEC接種于六孔板中，將不同濃度（0.001～10 mg/ml）F0001或安維汀與50 ng/ml VEGF預(yù)孵育30 min，再作用于HUVEC 5 min，然后收集細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解物在沸水浴中加熱變性。取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，而后用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將膜置于一抗溶液中溫育，再用含TBS/T洗滌。將膜置于二抗溶液中室溫反應(yīng)1 h；同上洗膜三次后，用ECL試劑發(fā)色、顯影。

2）對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的抑制作用（SRB法）[4，9] 接種一定數(shù)量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24 h，將不同濃度（0.3～3 000 ng/ml）F0001或安維汀與40 ng/ml VEGF預(yù)孵育30 min，再作用于HUVEC。每濃度設(shè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)相應(yīng)濃度溶媒對(duì)照。然后將HUVEC于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)72 h。SRB染色，加入CCK-8溶液，37 ℃放置4 h。用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，應(yīng)用公式：抑制率 =（對(duì)照孔細(xì)胞OD值-給藥孔細(xì)胞OD值）/對(duì)照孔細(xì)胞OD值×100%，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50。

3）對(duì)裸小鼠皮下移植瘤的療效[4，7] 裸小鼠分別皮下接種人結(jié)腸癌Ls-174t細(xì)胞或人肺癌NCI-H460細(xì)胞或人惡性膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞，待腫瘤生長(zhǎng)至100～150 mm3后，將各類荷瘤動(dòng)物分別隨機(jī)分組后給藥（D0），給藥劑量和給藥方案見(jiàn)表1。每周測(cè)瘤體大小2～3次，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算腫瘤體積及抑瘤率。

腫瘤體積（V）計(jì)算公式：V=1/2×a×b2，其中 a、b分別表示瘤長(zhǎng)、瘤寬；

根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算相對(duì)腫瘤體積（RTV），RTV=Vt/V0，其中V0為分籠給藥時(shí)（即D0）所測(cè)得的腫瘤體積，Vt為每次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。

應(yīng)用公式T/C（%）=（T-T0）/（C-C0）×100%，計(jì)算抑瘤率；抑瘤率（%）=100%-T/C（%）。其中T、C為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)給藥組、生理鹽水組的腫瘤體積；T0、C0為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)給藥組、生理鹽水組的腫瘤體積。

當(dāng)腫瘤出現(xiàn)消退時(shí)，抑瘤率（%）=100%-（T- T0）/T0×100%。如果腫瘤比起始體積縮小，即T

4）對(duì)裸小鼠的代謝動(dòng)力學(xué)[4，10] 裸小鼠皮下接種人結(jié)腸癌Ls-174t細(xì)胞，待腫瘤生長(zhǎng)至200～300 mm3后，將動(dòng)物隨機(jī)分組，分別單次靜脈注射F0001或安維汀1.5和5 mg/kg，給藥后5 min、4 h、24 h，48 h、72 h、96 h、168 h，各取4只小鼠，眼眶采集全血，凝血后離心采集血清；同時(shí)取腫瘤組織。血清、腫瘤組織于-80 ℃保存，最終檢測(cè)藥物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)VEGF刺激的VEGFR2/KDR信號(hào)的抑制作用

如圖1所示，VEGF顯著誘導(dǎo)高表達(dá)KDR的HUVEC細(xì)胞中的KDR磷酸化（左起，第2列）；F0001在1 mg/mL能明顯抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化，其抑制活性與參比抗體安維汀相當(dāng)。

注：左起第2列顯示，VEGF誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的KDR信號(hào)通路磷酸化，即P-KDR條帶變深；以及其下游信號(hào)ERK1/2的磷酸化，即P- ERK1/2條帶變深。隨著F0001劑量的增加（左起第3～7列），由于其對(duì)VEGF的中和抑制作用，VEGF誘導(dǎo)的磷酸化效應(yīng)逐步減弱，即P-KDR、P- ERK1/2條帶逐步變淡，比較明顯的效應(yīng)劑量是從1 mg/ml起

2.2 對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的抑制作用

F0001可顯著抑制VEGF刺激的HUVEC細(xì)胞增殖，其IC50為123 ng/ml，與安維?。↖C50 = 122 ng/ml）相當(dāng)（圖2）。

2.3 對(duì)裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用

F0001或安維汀對(duì)裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤效果見(jiàn)表2。

1） F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明顯抑制人結(jié)腸癌Ls- 174t裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為40%、47%和68%；安維汀 1.5/5 mg/kg對(duì)Ls-174t的抑瘤率分別為46%和63%。荷瘤小鼠對(duì)兩藥物均能很好耐受，沒(méi)有體重下降等癥狀發(fā)生?？傮w比較，二者對(duì)Ls-174t裸小鼠皮下移植瘤療效相當(dāng)。

2） CPT-11 6 mg/kg對(duì)Ls-174t的抑瘤率為60%；F0001或安維汀與CPT-11合用，療效顯著增強(qiáng)，抑瘤率分別從單藥的69%和68%提高到89%和89%。CPT-11單用使荷瘤小鼠體重下降，但與F0001或安維汀合用小鼠狀態(tài)有所改善，體重回升?？傮w比較，無(wú)論是單用還是與CPT-11合用，F(xiàn)0001和安維汀對(duì)結(jié)腸癌Ls-174t的療效相當(dāng)。

3） F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明顯抑制人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為53%、62%和68%；安維汀 1.5/5 mg/kg對(duì)NCI-H460的抑瘤率分別為57%和61%。荷瘤小鼠對(duì)兩藥物均能很好耐受，沒(méi)有體重下降等癥狀發(fā)生?？傮w比較，二者對(duì)NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤療效相當(dāng)。

4） F0001 1.5/5 mg/kg可明顯抑制人惡性膠質(zhì)瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為74%和86%；安維汀 1.5/5 mg/kg對(duì)U-87MG的抑瘤率分別為64%和83%。荷瘤小鼠對(duì)兩藥物均能很好耐受，沒(méi)有體重下降等癥狀發(fā)生?？傮w比較，二者對(duì)U-87MG裸小鼠皮下移植瘤療效相當(dāng)。

2.4 對(duì)裸小鼠的代謝動(dòng)力學(xué)

人結(jié)腸癌Ls-174t荷瘤裸小鼠單次靜脈注射F0001或安維汀 1.5/5.0 mg/kg后，血清藥物峰濃度時(shí)間Tmax均相同；同等劑量下，血清藥物濃度C0值和血清藥物暴露水平AUC0-t都比較接近，提示F0001與安維汀在荷瘤鼠中的血清藥代過(guò)程相似。

在腫瘤組織中，F(xiàn)0001或安維汀 5.0 mg/kg單次注射后的達(dá)峰時(shí)間Tmax、峰濃度Cmax、藥物暴露水平AUC0-t都比較一致?？傮w結(jié)果提示，二者在荷瘤裸小鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)（PK/PD）過(guò)程相似。

3 討論

早期我們從體外作用機(jī)制及活性、體內(nèi)對(duì)裸小鼠荷人結(jié)腸癌Ls-174t（包括單藥及與化療藥合用）、肺癌NCI-H460、惡性膠質(zhì)瘤U-87MG的抑瘤活性等方面研究了F0001的臨床前主要藥效學(xué)，隨著我國(guó)《生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的出臺(tái)[11]，我們結(jié)合本品藥代動(dòng)力學(xué)（PK）試驗(yàn)（另行試驗(yàn)研究）補(bǔ)充進(jìn)行了本品在荷瘤裸小鼠的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)（PK/PD）的試驗(yàn)研究。

試驗(yàn)中由于試劑、耗材、及96孔板細(xì)胞復(fù)孔的均一性等原因，部分單孔OD值數(shù)據(jù)出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，但不影響F0001隨濃度增加對(duì)VEGF的抑制作用。后續(xù)本品生產(chǎn)中活性檢測(cè)的質(zhì)控將得到優(yōu)化。

F0001與安維汀在荷人結(jié)腸癌Ls-174t裸小鼠中的血清藥代過(guò)程相似，高劑量（5.0 mg/kg）時(shí)二者在腫瘤組織中的暴露水平也一致。但是，在低劑量（1.5 mg/kg）時(shí)二者在腫瘤組織中的暴露水平有差異，AUC0-t分別為4.24和13.71 h·mg/ml，分析其原因主要是受試品在腫瘤組織中48 h后的濃度已均低于定量下限。

總體而言，F(xiàn)0001與安維汀體外作用機(jī)制及活性相當(dāng)、體內(nèi)抑瘤效果相當(dāng)，二者在人結(jié)腸癌Ls-174t荷瘤小鼠體內(nèi)PK/PD參數(shù)相似；F0001與原研藥安維汀在主要藥效學(xué)方面高度類似。

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