王曉飛 沈運旺 朱玨 張博

摘?要?慢性無機砷暴露可引發(fā)多種疾病和損害， 但其所涉及的生物學過程尚未完全闡明。全球約有超過2億人面臨飲用水砷污染的威脅。本研究以自由飲水的方式對健康大鼠進行無機砷的長期暴露， 并對大鼠尿液的代謝組變化進行系統(tǒng)分析。結(jié)果表明， 長期砷暴露大鼠的尿液代謝組與對照組具有顯著區(qū)別， 且高劑量砷暴露對大鼠尿液代謝組產(chǎn)生的影響更顯著。本研究共鑒定出36種差異代謝物， 其中14種與氨基酸代謝相關(guān)的代謝物發(fā)生了顯著變化， 涉及到色氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸降解、β-丙氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝; 11種與脂類代謝相關(guān)的代謝物， 涉及到的代謝通路有鞘脂代謝、脂肪酸代謝; 同時發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達與翻譯后修飾也受到干擾。這些生物學過程的改變均可作為砷毒性機理的關(guān)鍵分子事件。

關(guān)鍵詞?砷暴露; 代謝組學; 尿液; 長期暴露; 液相色譜-質(zhì)譜

1?引 言

砷廣泛存在于環(huán)境中， 無機砷具有極大毒性， 已被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為I類致癌物。飲用水砷污染是人類暴露于砷的主要途徑[1，2]， 在全球范圍內(nèi)有超過2億人的飲用水中含有較高濃度的砷。高砷地區(qū)的流行病學調(diào)查表明， 慢性無機砷暴露與多種疾病風險的增高具有相關(guān)性[3～5]， 近期的研究發(fā)現(xiàn)， 即使普通環(huán)境劑量的飲水砷暴露也存在一定的健康風險[6，7]。近年來快速展的組學技術(shù)已被應(yīng)用于砷毒性的研究中， 基于動物模型的蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)， 砷暴露能夠損害心血管系統(tǒng)的發(fā)育和正常功能[8]。在低劑量砷暴露人群的尿液代謝組學研究中， 發(fā)現(xiàn)五價無機砷暴露量的升高與男性不育呈現(xiàn)相關(guān)性， 并且砷可能引發(fā)氧化應(yīng)激增強和擾亂性激素代謝過程[7]。

代謝組學技術(shù)是系統(tǒng)生物學的重要組成部分， 基于現(xiàn)代色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺對代謝物進行研究， 通過分析生物體中代謝物的變化， 揭示生命活動規(guī)律[9，10]。代謝組學技術(shù)應(yīng)用于污染物毒性研究， 可以直接觀察到與污染物相關(guān)的代謝物變化， 進而在小分子層面揭示污染物的毒性機理[11～13]。代謝組學技術(shù)在毒性機理研究中仍存在許多挑戰(zhàn)， 如代謝組學技術(shù)研究方法的多樣性[14]、追蹤代謝物變化所影響的特定代謝途徑和毒性效應(yīng)仍具有挑戰(zhàn)性[15，16]、代謝物濃度的巨大差異帶來的檢測困難， 以及由于鑒定能力和數(shù)據(jù)庫不完善帶來的大量代謝物質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)浪費[17]。

代謝物是連接環(huán)境風險因素與生物體健康的橋梁。如血液和尿液中的代謝物變化可以反映個體在分子層面對環(huán)境脅迫的響應(yīng)， 高通量代謝組學能夠篩選代謝物的變化[6，7，18，19]， ?進而全面了解環(huán)境脅迫對生物體代謝通路的影響。該策略已應(yīng)用于小鼠、蛤和跳蚤的砷暴露代謝干擾效應(yīng)研究[20～23]。 在現(xiàn)有的砷毒性研究中， 多采用急性和高劑量的砷暴露模式， 尚不能真實反映出人飲水型長期砷暴露的實際情況。本研究對大鼠進行長期的無機砷飲水暴露， 覆蓋了大鼠幼年至成年期， 分析了尿液代謝組， 基于代謝組學的高分析通量和差異代謝物的篩選功能， 將砷暴露與尿液代謝物的相應(yīng)變化關(guān)聯(lián)， 結(jié)合相關(guān)代謝通路分析探究了長期無機砷暴露的毒性機理， 以期對長期砷暴露的健康風險評估提供參考。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）-Q Exactive質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）聯(lián)用代謝組學檢測平臺。 甲醇（色譜純， 德國Merck公司）; 甲酸（質(zhì)譜純， 百靈威J&K公司）; NaAsO2（純度>98.5%， 比利時Acros公司）; 去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

2.2?實驗方法

2.2.1?動物實驗分組與染毒方法?SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠（4周齡， 體重80 g）購自上海SLAC動物實驗中心。大鼠飼養(yǎng)于溫度為（26 ± 2）℃、相對濕度為50%±5%、12/12 h晝夜循環(huán)的動物房內(nèi)， 所有大鼠自由攝取食物和飲用水。經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)和檢疫后， 大鼠隨機分成3組， 每組10只。暴露組大鼠分別飲用濃度為1.0和25.0 mg/L的NaAsO2溶液， 對照組大鼠飲用去離子水。

經(jīng)過150天暴露后， 利用代謝籠收集大鼠尿液， 在4℃以12000 g離心10 min， 于80℃儲存， 待分析。

2.2.2?尿液檢測?（1）樣品制備?從80℃取出尿液， 依次在20℃和4℃下逐步解凍。每種樣品中取出500 μL尿液， 加入等體積的去離子水， 在4℃以12000 g離心10 min， 取上清液， 待測。同時， 從每種樣品中取出20 μL混勻， 作為質(zhì)量控制（QC）樣品。（2）液相色譜分離條件?利用UPLC/Q Exactive-MS聯(lián)用平臺采集尿液代謝指紋圖譜， 使用Waters公司的ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm）; 流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液， 流動相B為含有0.1%甲酸的甲醇溶液， 梯度洗脫條件：初始流動相為0.1% B， 維持1 min， 4 min時升至6.0% B， 15 min時升至50% B， 21 min時升至99.9% B并維持2.5 min， 隨后快速恢復初始0.1% B， 并保持1.5 min; 進樣體積為10 μL; 流速為400 μL/min; 柱溫為40℃。（3）質(zhì)譜條件?采用電噴霧離子源（ESI）， 同時在正、負離子模式下采集數(shù)據(jù)， Full MS分辨率為17500， 掃描范圍為m/z 100～1000。載氣為氮氣， 正、負模式下噴針電壓均為3500 V， 離子傳輸毛細管溫度為320℃; 鞘氣和輔助氣流量分別為50和12.5 L/min。隨機進樣， 每種樣品檢測2次， 以消除人為或儀器造成的系統(tǒng)誤差， QC樣品每隔10種樣品檢測1次。Full MS/dd-MS2模式用于獲得標志物的二級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息， NCE設(shè)置為30%。

2.2.3?尿液代謝組檢測數(shù)據(jù)分析?將UPLC/Q Exactive-MS聯(lián)用平臺采集到的代謝物指紋圖譜數(shù)據(jù)導入Compound Discoverer 2.1軟件進行峰對齊、代謝物離子信息提取與鑒定， 得到包含代謝物分子量、分子式、離子峰面積的信息表。數(shù)據(jù)進行歸一化后導入SIMCA-P（Version 14.1 MKS Umetrics）， 首先進行主成分分析（PCA）， 基于QC樣品聚合情況考察儀器方法的穩(wěn)定性， 隨后進行正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）， 并通過SPSS（Version 24， IBM）和MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）進行統(tǒng)計學分析。差異代謝物的篩選標準為：VIP值（Variable Importance in the Projection）≥1.5， 兩組間變化倍數(shù)≥2（暴露組vs對照組）， p<0.05（暴露組vs對照組）。將滿足上述條件的代謝物導入HMDB（http：//www.hmdb.ca/）進行檢索， 排除非內(nèi)源性物質(zhì)和非大鼠物種來源物質(zhì)， 并對其生物學意義進行分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?砷暴露劑量的選擇

全球天然水體中砷濃度范圍為0.0005～5.0 mg/L， 如印度西孟加拉邦地區(qū)的地下飲用水中砷濃度達到了3.7 mg/L[24，25]。飲用水中砷的主要存在狀態(tài)有As和As [26]， 且As的毒性遠大于As[27]， 為了更真實地反映飲水砷暴露的健康影響， 選擇NaAsO2溶液作為砷暴露源。在本研究中選用25.0 mg/L NaAsO2作為最高暴露劑量， 相當于14.4 mg/L的砷暴露量， 依據(jù)動物與人類間劑量轉(zhuǎn)換算法[28]， 這相當于人類暴露于2.3 mg/L的砷; 為了反映人類常規(guī)飲水砷暴露狀態(tài)， 選用1.0 mg/L NaAsO2作為低暴露劑量組。同樣， 25.0 mg/L NaAsO2暴露量（相當于4.0 mg/kg bw）約為大鼠口服半致死量（41.0 mg/kg bw）的1/10[29]。因此， 本研究中使用的暴露劑量涵蓋了環(huán)境砷暴露最高水平、常規(guī)飲水砷暴露水平和大鼠NaAsO2的半致死量， 與環(huán)境相關(guān)并具有毒理學意義。

3.2?代謝組學分析

在正、負離子2種掃描模式下同時對樣品中的代謝物進行檢測， 盡可能獲得所有代謝物的信息。圖1為大鼠尿液代謝組輪廓的代表性指紋圖譜， 可以看出譜圖中含有豐富的代謝物信息。

在代謝組學分析過程中， 通常伴隨著顯著的質(zhì)譜信號漂移， 為了消除這種變化， 常添加一種或多種內(nèi)標校正信號[30]， 或采用QC樣品評估信號漂移狀態(tài)并進行信號校正[31，32]。本研究采用statTarget工具對所有數(shù)據(jù)進行校正（QC-RFSC）[32]。QC樣品（n=9）檢測均勻覆蓋全部樣品分析序列， 通過對所有QC樣品數(shù)據(jù)中代謝物離子的保留時間和信號強度進行分析， 可以檢驗方法的可靠性及LC-MS平臺的穩(wěn)定性。采用PCA方法對所有樣品數(shù)據(jù)進行模式識別， 結(jié)果如圖2所示， QC樣品聚合良好， 表明本研究中代謝組學分析方法穩(wěn)定可靠， 數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足進一步多變量組學分析的要求。

在代謝組學數(shù)據(jù)分析中， 正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）作為偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）的改進方法， 常被用于區(qū)分兩組或多組數(shù)據(jù)， 與PLS-DA相比， OPLS-DA模型的假陽性率更低， 結(jié)果更準確[33]。分別對暴露組與對照組進行OPLS-DA分析和置換檢驗。如圖3所示， OPLS-DA分析表明， 2種劑量組與對照組均能夠?qū)崿F(xiàn)良好的聚類區(qū)分， 模型經(jīng)過驗證可靠， 表明長期飲水砷暴露對大鼠的尿液代謝組產(chǎn)生了顯著影響。

將提取的代謝物離子信息表導入MetaboAnalyst 4.0進行統(tǒng)計學分析， 對暴露組和對照組中代謝物離子強度變化倍數(shù)（FC）及t檢驗的p值進行比較（圖4）， 結(jié)果表明， 暴露組與對照組的大鼠尿液中存在大量的差異代謝物（圖4中紅色圓點， FC>2且p<0.05）， 且高劑量比低劑量暴露組中存在更多的差異性代謝物離子。依據(jù)變量在OPLS-DA區(qū)分投影中的重要性（VIP）、兩組間變化倍數(shù)及差異顯著性， 最終篩選出36種差異代謝物（表1， 低劑量組14種， 高劑量組32種， 2種劑量組中同時鑒定到10種）。差異代謝物在暴露組與對照組尿液中的變化熱圖（圖6）顯示， 13種差異代謝物在砷暴露組大鼠尿液中的含量顯著上調(diào)， 23種代謝物含量顯著下調(diào)。將差異代謝物導入MetaboAnalyst 4.0， 經(jīng)Pathway Analysis和Statistical Analysis分析， 表明差異代謝物涉及氨基酸代謝、谷胱甘肽代謝、嘌呤代謝、鞘脂代謝和氨?；?tRNA生物合成等通路（圖5）。

3.3?基于代謝組學分析的砷暴露毒性效應(yīng)

3.3.1??長期砷暴露引起生物體整體代謝異常?砷暴露會擾亂機體內(nèi)氧化/抗氧化平衡， 造成機體氧

化損傷[34，35]， 影響細胞生長[36]、DNA修復[37]和表達調(diào)節(jié)[38～41]。流行病學研究表明， 砷暴露是糖尿病[42～44]和心血管疾病[45～47]等代謝類疾病的危險因素。尿液中包含了大量代謝物信息， 尿液代謝組學研究已被廣泛應(yīng)用于污染物毒理研究中[18，48，49]， 對大鼠尿液進行代謝組分析， 能夠準確地反映出生物體整體代謝輪廓的變化。本研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)過長期的砷暴露， 大鼠尿液中有14種與氨基酸代謝相關(guān)的代謝物發(fā)生了顯著變化（4種含量上升、10種含量下降）， 在25.0 mg/L暴露組鑒定出12種， 1.0 mg/L暴露組鑒定出8種， 涉及到的氨基酸通路有色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）、精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、賴氨酸降解（Lysine degradation）、β-丙氨酸代謝（β-Alanine metabolism）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine， serine and threonine metabolism）（圖5）; 同時， 也鑒定出11種與脂類代謝相關(guān)的代謝物（6種含量上升、5種含量下降）， 其中在25.0 mg/L暴露組鑒定出10種， 1.0 mg/L暴露組鑒定出2種， 涉及到的代謝通路有鞘脂代謝（Sphingolipid metabolism）、脂肪酸代謝。慢性砷暴露已被證明與糖尿病和心血管疾病密切相關(guān)， 這些疾病的典型特征是生物體內(nèi)糖類、脂類和氨基酸的代謝紊亂[50，51]。以上結(jié)果表明， 長期砷暴露能夠引起生物體整體代謝異常， 并且高劑量（25.0 mg/L）暴露比低劑量（1.0 mg/L）暴露產(chǎn)生的代謝影響更顯著。

3.3.2?長期砷暴露擾亂氧化/抗氧化平衡， 引起核苷酸代謝紊亂?砷暴露能夠引起生物體產(chǎn)生多種損傷， 其毒性機理在分子層面還未完全明確， 氧化/抗氧化失衡導致的氧化應(yīng)激是被廣泛接受和深入研究的方向之一[52]; 長期砷暴露引起的氧化/抗氧化失衡是眾多砷毒害的誘因， 進而造成致癌、遺傳毒性、生殖毒性、皮膚損傷、代謝系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)病變等[34]。在砷暴露大鼠尿液中鑒定出涉及谷胱甘肽代謝通路的代謝物有精胺（Spermine）、亞精胺（Spermidine）和焦谷氨酸（Pyroglutamic acid）， 且含量均下降。這表明砷暴露可能破壞了大鼠體內(nèi)的谷胱甘肽代謝循環(huán)（機體內(nèi)維持氧化/抗氧化平衡的重要生物學過程）[53，54]， 進而對大鼠機體產(chǎn)生氧化損傷。另外， 暴露組中5種與核苷酸代謝相關(guān)的代謝物產(chǎn)生了顯著變化（2種含量上升， 3種含量下降）， 其中， 次黃嘌呤（Hypoxanthine， 下降）和黃嘌呤（Xanthine， 上升）是尿酸（Uric acid， 上升）合成的前體， 尿酸是嘌呤氧化的最終產(chǎn)物， 這表明長期砷暴露可能通過擾亂機體內(nèi)氧化/抗氧化平衡， 干擾核苷酸代謝， 并影響機體內(nèi)正常的生物學過程。

3.3.3?長期砷暴露干擾蛋白質(zhì)表達與翻譯后修飾?氨基酸的tRNA轉(zhuǎn)運及蛋白質(zhì)翻譯后修飾對于蛋白質(zhì)的合成和功能化具有重要意義。與對照組相比， 砷暴露組中蛋氨酸（Methionine）和N-乙?；?賴氨酸（N6-acetyllysine）的含量分別顯著上升和下降。蛋氨酸與氨酰-tRNA的生物合成過程相關(guān)， N-乙酰基-賴氨酸是一種乙?；被幔?賴氨酸乙?；且环N重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾， 這說明長期砷暴露擾亂了大鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達和翻譯后修飾過程。

4?結(jié) 論

利用代謝組學技術(shù)對不同劑量長期飲水砷暴露大鼠尿液的代謝組進行了對比分析， 發(fā)現(xiàn)長期砷暴露對大鼠體內(nèi)整體代謝產(chǎn)生了顯著影響， 在低劑量和高劑量暴露組中分別鑒定出14種和32種差異代謝物， 其中10種差異代謝物在2種劑量組中均被鑒定出， 這表明長期高劑量砷暴露對機體代謝產(chǎn)生的干擾更顯著。對差異代謝物涉及的代謝通路進行分析， 結(jié)果表明， 長期砷暴露會導致氨基酸和脂類代謝異常及核苷酸代謝紊亂， 并干擾蛋白質(zhì)的表達與翻譯后修飾。以上通路的改變均可作為砷毒性機理的關(guān)鍵分子事件， 以此為靶點， 結(jié)合常規(guī)毒理學研究方法和多組學聯(lián)用技術(shù)， 對這些生物學過程中的關(guān)鍵節(jié)點進行深度研究， 有助于對砷毒性分子機制的深度解析。

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