陳從立 周奕含 崔曉春 王建偉

摘?要?污水及再生水中所含有的微生物在一定條件下會(huì)形成生物膜， 從而增加了再生水后續(xù)利用的難度。本研究以牛血清蛋白（Bovine serum albumin， BSA）為模式蛋白， 埃希氏大腸桿菌為模式菌， 通過(guò)檢測(cè)不同蛋白質(zhì)濃度下大腸桿菌所形成的生物膜含量， 分析了外源蛋白對(duì)生物膜形成的影響， 通過(guò)FTIR及XPS深入探究了其中的作用機(jī)制。結(jié)果表明， 生物膜中的生物量隨蛋白濃度的提高而增加。加入8.0 mg/L蛋白質(zhì)可使菌懸液中微生物的Zeta電位值下降約35%;添加外源蛋白可使微生物的疏水性增強(qiáng);蛋白質(zhì)的官能團(tuán)與菌體表面的官能團(tuán)相互作用提高了微生物的聚集性， 并刺激了微生物胞外多糖的生成。本研究為污廢水處理及再生水利用過(guò)程中生物膜形成及控制方面提供了重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?生物膜; 外源蛋白; 溶解性微生物產(chǎn)物; 疏水性; 胞外多糖

1?引 言

在現(xiàn)代水處理工藝中， 生物處理技術(shù)已廣泛應(yīng)用于市政污水和工業(yè)廢水的處理。利用生物處理技術(shù)使水體中化學(xué)需氧量（Chemical oxygen demand， ?COD）、氨氮、懸浮固體等常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)達(dá)標(biāo)的同時(shí)， 常忽略出水中殘留的溶解性微生物產(chǎn)物（Soluble microbial products， SMPs）。SMPs主要是由蛋白質(zhì)、多聚糖以及腐殖酸等物質(zhì)組成， 這些物質(zhì)主要來(lái)源于未被充分降解的天然有機(jī)物和微生物死亡后的胞內(nèi)溶出物[1～3]。研究表明， SMPs的存在對(duì)污水及再生水處理工藝造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響， 如引起膜污染，以及污水再生過(guò)程中產(chǎn)生消毒副產(chǎn)物[1，4]。

蛋白質(zhì)作為SMPs的重要組成成分之一， 在現(xiàn)有的二級(jí)處理工藝出水中的濃度為3～12 mg/L[5，6]。二級(jí)出水中的殘余溶解性微生物蛋白通常不易被微生物降解利用， 而污水深度處理如強(qiáng)化混凝等傳統(tǒng)的再生工藝很難將其去除[6]， 在水環(huán)境中可長(zhǎng)期存在[5]。這類(lèi)蛋白質(zhì)分子量主要分布在<0.5 kDa和>50 kDa兩個(gè)區(qū)域[7]。大分子量的蛋白質(zhì)很難被生物降解， 這類(lèi)大分子蛋白質(zhì)與目前報(bào)道的生物絮凝劑具有極大的相似性， 因此可通過(guò)吸附架橋和網(wǎng)捕卷掃作用，使水體中懸浮顆粒和膠體粒子有效地團(tuán)聚[8，9]。在污廢水生化處理工藝的出水中共存著大量微生物和溶解性微生物蛋白質(zhì)， 這些蛋白質(zhì)的存在可能會(huì)促進(jìn)微生物細(xì)胞的聚集。深入探究這類(lèi)蛋白對(duì)微生物的作用對(duì)污水處理下游工藝的有效運(yùn)行和水環(huán)境保護(hù)具有重要意義。然而， 目前關(guān)于該類(lèi)外源難降解微生物蛋白對(duì)微生物影響的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

目前已有的研究結(jié)果表明， 內(nèi)源性蛋白通過(guò)減弱胞體間的靜電斥力、增強(qiáng)胞體表面的疏水性等作用使微生物相互聚集[10～12]， 因此， 可以推測(cè)， 生物處理工藝出水中殘余的溶解性微生物蛋白作為外源蛋白同樣可以影響微生物的聚集，并通過(guò)物理化學(xué)作用促進(jìn)生物膜的形成。本研究以污水處理中常用的模式蛋白和微生物為研究對(duì)象， 考察了外源蛋白對(duì)微生物形成生物膜的影響， 并通過(guò)對(duì)生物膜的微觀結(jié)構(gòu)觀察、生物膜生物量的測(cè)定，以及生物膜性質(zhì)的表征和分析， 深入探究了外源蛋白促進(jìn)微生物成膜的作用機(jī)制。

2?實(shí)驗(yàn)方法

2.1?儀器與試劑

CKX41倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）; RT-6000酶標(biāo)儀（中國(guó)Rayto生命科學(xué)分析技術(shù)有限責(zé)任公司）; TGL-16K離心機(jī)（湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器發(fā)展有限公司）; Pilot1-2冷凍干燥機(jī)（博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)有限公司）; MalvernNano-ZS90電位測(cè)定儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）; JC2000C接觸角測(cè)定儀（上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司）。

LB培養(yǎng)基（Luria broth LB 北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司）; 甲醇，乙醇，HCl，H2SO4，NaOH（分析純，北京化工廠(chǎng)）; 結(jié)晶紫（純度>99%，河北三順教學(xué)儀器有限公司）; 苯酚（純度>99%，天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)）。

2.2?模式微生物和模式外源蛋白的選擇

選用大腸桿菌為目標(biāo)微生物， 采用純菌體系培養(yǎng)生物膜， 大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922， 廣州工業(yè)微生物檢測(cè)中心）是生活中常見(jiàn)的微生物之一， 也是污水處理廠(chǎng)出水中的代表性細(xì)菌， 被廣泛作為培養(yǎng)生物膜的模式微生物。

二級(jí)出水中所含蛋白質(zhì)具有分子量大、生物降解性差的特點(diǎn)。本研究選取牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA， Sigma 9048-46-8 USA， 純度>98%）為模式蛋白。BSA由607個(gè)氨基酸組成， 分子量約為66 kD， 其分子表面含有親疏水基團(tuán)而具有一定的表面活性， 等電點(diǎn)4.7， 難以被微生物降解， 是一種常用于研究水質(zhì)及水質(zhì)凈化的模式蛋白質(zhì)[13，14]。

培養(yǎng)基選取無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.563 g/L， NH4Cl 0.385 g/L， K2HPO4·3H2O 0.04 g/L， KH2PO4 0.023 g/L， MgSO4 0.012 g/L， CaCl2 0.03 g/L（分析純， 北京化工廠(chǎng)）和1 mL微量元素A5溶液。

2.3?實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1?大腸桿菌的復(fù)壯及培養(yǎng)基的配制?大腸桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基（Luria broth， LB）中， 37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取細(xì)菌懸液在8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min， 菌體沉淀用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， pH=7.2）重懸， 并重復(fù)清洗3次， 以去除細(xì)菌表面的培養(yǎng)基。將菌體重懸于20 mmol/L PBS溶液中， 調(diào)節(jié)其OD600=0.5， 作為細(xì)菌貯存液（細(xì)菌細(xì)胞的濃度～108 CFU/mL）。配制80 mg/L BSA蛋白質(zhì)貯存液。向無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加不同體積的蛋白質(zhì)貯存液， 使蛋白濃度分別達(dá)到0、 2.0、 4.0和8.0 mg/L。

2.3.2?生物膜的培養(yǎng)?使用24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行生物膜培養(yǎng)， 其中24孔孔板內(nèi)放置滅菌后的玻璃爬片。將細(xì)菌細(xì)胞的貯存液與含有不同濃度蛋白的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基按照1%（V/V）的比例加入孔板中。24孔板每孔加入體積為2 mL， 96孔板每孔加入體積為200 μL。將微孔板放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中（37℃， 90 r/min）培養(yǎng)。

2.3.3?生物膜的顯微鏡表征?將24孔板中培養(yǎng)8 和48 h的生物膜爬片取出， 用20 mmol/L PBS （pH 7.2）溶液清洗3次， 以去除爬片表面松散附著的細(xì)菌細(xì)胞和培養(yǎng)基基質(zhì)， 然后用0.1% 結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行染色5 min。染色完成后， 將爬片放置在載玻片上， 使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.3.4?生物膜的定量分析?使用結(jié)晶紫染色法對(duì)培養(yǎng)好的生物膜進(jìn)行定量測(cè)定[15]。生物膜培養(yǎng)完成后， 移去細(xì)胞懸液。向每孔中加入200 μL 99% 甲醇， 對(duì)生物膜進(jìn)行固定， 15 min后將甲醇吸出， 并將孔板倒置晾干。每孔加入200 μL 0.1% 結(jié)晶紫溶液， 對(duì)生物膜進(jìn)行染色5 min。用20 mmol/L PBS溶液（pH 7.2）清洗5次， 并將孔板倒置晾干。向每孔中加入160 μL 95% 乙醇， 將生物膜上的染色劑溶解下來(lái)， 將其中的100 μL溶液轉(zhuǎn)移到新的孔板中。使用酶標(biāo)儀對(duì)溶解下來(lái)的結(jié)晶紫在570 nm條件下進(jìn)行檢測(cè)， 以對(duì)生物膜的形成進(jìn)行定量分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)10個(gè)微孔。

2.3.5?Zeta電位測(cè)量?用超純水稀釋細(xì)菌儲(chǔ)存液至～107 CFU/mL， 然后加入適量蛋白質(zhì)貯存溶液， 使蛋白質(zhì)濃度達(dá)到0～8.0 mg/L。在不同濃度蛋白質(zhì)下， 檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞的Zeta電位。

2.3.6?接觸角測(cè)定?根據(jù)2.3.1節(jié)的方法配制含有不同蛋白濃度（0＼， 2.0＼， 4.0和8.0 mg/L）的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基菌懸液， 使用接觸角測(cè)定儀自動(dòng)獲取相同體積的菌懸液， 緩慢提升載體玻璃片與菌懸液接觸， 測(cè)定接觸角， 每個(gè)濃度條件重復(fù)測(cè)定6次。

2.3.7?光譜分析的樣品制備?從24孔板的5個(gè)孔中將培養(yǎng)了48 h的生物膜刮下， 并收集在20 mL 超純水中， 在8000 r/min下離心10 min， 棄去上清液， 將沉淀物在80℃條件下冷凍干燥24 h， 對(duì)得到的干燥生物質(zhì)進(jìn)行X-射線(xiàn)光電子能譜及傅里葉變換紅外光譜表征。

2.3.8?胞外多糖的測(cè)定?收集培養(yǎng)好的生物膜， 使用20 mmol/L PBS（pH=7.2）清洗3次， 在4℃下， 3000 r/min離心10 min。固體重懸于去離子水中， 30℃水浴孵育60 min。在4℃下， 12000 r/min離心30 min， 獲得胞外聚合物提取液。胞外多聚糖使用苯酚-濃硫酸法測(cè)定[15，16]。

3?結(jié)果與討論

3.1?外源蛋白對(duì)生物膜形成效果的影響

在4個(gè)濃度（0、2.0、4.0和8.0 mg/L）的外源蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)8和48 h的微生物生物膜， 經(jīng)結(jié)晶紫染色顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。在相同培養(yǎng)時(shí)間下， 隨著蛋白質(zhì)溶液濃度的提高， 載體表面的微生物聚集的數(shù)量和體積均增大， 表明生物膜的形成效果隨蛋白質(zhì)濃度的提高而逐漸增強(qiáng)， 蛋白質(zhì)促進(jìn)了微生物生物膜的形成。

為進(jìn)一步驗(yàn)證生物膜形成效果， 將載體表面緊密附著的生物膜用結(jié)晶紫進(jìn)行染色， 經(jīng)甲醇洗脫后，測(cè)定相同面積載體表面上的生物量， 結(jié)果如圖2所示，培養(yǎng)8和48 h的生物膜中生物量的變化趨勢(shì)一致， 即隨著蛋白濃度提高， 形成的生物膜的量逐漸增多。

3.2?外源蛋白促進(jìn)微生物生物膜形成的機(jī)理

3.2.1?外源蛋白對(duì)微生物聚集和沉降的影響?BSA作為一種生物大分子， 其空間結(jié)構(gòu)及表面電性隨溶液pH值的變化而變化， 從而影響了菌懸液中微生物及膠體分子的Zeta電位[17，18]。Zeta電位易通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)定， 可定量反映固相表面的荷電狀態(tài)[19]， 其數(shù)值與膠態(tài)分散的穩(wěn)定性相關(guān)， 是對(duì)顆粒之間相互排斥或吸引力強(qiáng)度的度量。Zeta電位的絕對(duì)值越高， 體系越穩(wěn)定， 即顆粒在溶液中分散， 不易凝聚。

反之， Zeta電位越低， 越傾向于凝聚。Zeta電位測(cè)定結(jié)果顯示， 隨著pH值增高， 不同濃度BSA菌懸液中微生物的Zeta電位值持續(xù)降低（圖3）。如圖3中圓圈標(biāo)識(shí)所示， 添加不同濃度蛋白質(zhì)溶液， 將pH值維持在6.9～7.0之間。添加4.0和8.0 mg/L的蛋白質(zhì)溶液的Zeta電位絕對(duì)值比不添加蛋白質(zhì)的對(duì)照組溶液Zeta電位絕對(duì)值降低約35%， 與Xie等[2]的研究結(jié)果趨勢(shì)一致。根據(jù)Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek（DLVO）理論可知， Zeta電位絕對(duì)值的降低說(shuō)明BSA的加入使得溶液中微生物-微生物、微生物-BSA間的靜電斥力減小， 微生物與蛋白質(zhì)分子間易相互聚集， 形成復(fù)合物， 進(jìn)而促進(jìn)初始生物膜的形成。

3.2.2?外源蛋白對(duì)微生物細(xì)胞疏水性的影響?測(cè)定了含有不同濃度蛋白質(zhì)的菌懸液與載體表面的接觸角（圖4）， 結(jié)果表明， 當(dāng)溶液中不添加蛋白質(zhì)時(shí)， 菌懸液與載體表面的接觸角為41.2°; 隨著蛋白質(zhì)濃度提高， 接觸角變小， 當(dāng)添加蛋白濃度為8.0 mg/L時(shí)， 接觸角減小至16.7°。

上述結(jié)果說(shuō)明， BSA的添加顯著增強(qiáng)了BSA-微生物的疏水性， 微生物更易在載體表面附著， 促進(jìn)了生物膜的初步形成。這是因?yàn)锽SA與微生物自分泌的內(nèi)源性胞外蛋白類(lèi)似， 其分子具有多種疏水性氨基酸殘基， 如苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等， 使其具備穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)[20]。當(dāng)BSA與微生物共存時(shí)，二者間的相互作用可能使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化， 蛋白內(nèi)部的疏水性基團(tuán)更多地暴露于環(huán)境中， 引起B(yǎng)SA-微生物的疏水性增強(qiáng)[21，22]。另外， 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中非極性部分與菌表面的非極性部分周?chē)杏行蚺帕械乃肿哟嬖冢?且二者接近到一定程度時(shí)， 由于空間的減小， 會(huì)將有序的水分子排擠出來(lái)， 從而發(fā)生水合現(xiàn)象， 加劇蛋白與微生物的結(jié)合與沉降。

3.2.3?BSA與微生物間的鍵合作用?為探究外源蛋白的加入對(duì)形成生物膜組分的影響， 分別對(duì)單純BSA及有無(wú)外源BSA添加形成的生物膜進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析（圖5）。結(jié)果表明， 不加BSA的細(xì)菌形成的生物膜與BSA的紅外譜圖相似， 差異較小。當(dāng)添加8.0 mg/L蛋白質(zhì)后， 歸屬于酰胺I帶α-螺旋的1648 cm1偏移至1641 cm1， 歸屬于酰胺II帶的1544 cm1明顯地偏移至1558 cm1， 這種偏移主要是由蛋白質(zhì)分子中?；鵆ONH的CN伸縮振蕩導(dǎo)致的[22]。類(lèi)似的， 當(dāng)添加蛋白質(zhì)后， 歸屬于BSA酰胺III帶的β-折疊結(jié)構(gòu)的子峰1240/1241 cm1偏移至無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的子峰1257 cm1， 整個(gè)譜圖的峰呈現(xiàn)出高波數(shù)的峰藍(lán)移、低波數(shù)的峰紅移的變化。 α-螺旋和β-折疊的遷移以及無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)均說(shuō)明BSA與微生物的相互作用使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化[23，24]。與純生物膜組的譜圖相比， 加入BSA后， 生物膜多糖成分中的COC（1078 cm1）偏移至1098 cm1， 且在1041 cm1出現(xiàn)一個(gè)新峰， 此峰是由多聚糖分子中C-H鍵伸縮形變產(chǎn)生[25]。說(shuō)明外源蛋白的存在引起生物膜中胞外聚合物的變化， 尤其是多聚糖的種類(lèi)和含量。 因此， 當(dāng)外源蛋白存在時(shí)， 微生物和蛋白質(zhì)的相互作用引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化， 增強(qiáng)了微生物的疏水性， 使得生物膜中胞外聚合物的組分發(fā)生改變， 多糖含量增加。

X射線(xiàn)光電子能譜（XPS）表征結(jié)果（圖6）進(jìn)一步說(shuō)明了BSA與微生物間的鍵合作用對(duì)生物膜形成的影響。未添加外源蛋白形成生物膜的C1s能譜中含有283.80 （±0.5）、 285.12 （±0.3）和 287.61 eV的峰， 分別對(duì)應(yīng)C（C，H）、C（O，N）和CO[12，26]（圖6A）。如圖6B所示， 當(dāng)添加8.0 mg/L BSA培養(yǎng)生物膜時(shí)，CO的峰面積由3.6%增長(zhǎng)至17.1%。結(jié)合傅里葉變換紅外光譜表征結(jié)果， 推測(cè)外源蛋白參與了生物膜的形成， 并刺激多聚糖的產(chǎn)生。

3.2.4?外源蛋白對(duì)生物膜中胞外多糖產(chǎn)生量的影響?生物膜由微生物細(xì)胞和胞外聚合物組成， 而蛋白質(zhì)和多糖是胞外聚合物的主要成分，

多糖含量的變化與生物膜的性質(zhì)密切相關(guān)[29]。為進(jìn)一步驗(yàn)證FTIR以及XPS的結(jié)果， 測(cè)定了不同條件下培養(yǎng)的生物膜中的多糖含量（圖7）。結(jié)果表明， 當(dāng)添加0、2.0、4.0和8.0 mg/L的外源蛋白時(shí)， 單位質(zhì)量生物膜中的胞外多糖的質(zhì)量分別為0.89＼， 1.01＼， 1.18和1.27 mg。 胞外多糖的含量隨著蛋白濃度的提高而增加。因此， 添加低濃度的外源蛋白可以顯著增強(qiáng)微生物多糖的分泌。多糖含量的增加有利于微生物粘附在載體表面， 增強(qiáng)微生物間的凝聚; 同時(shí)， 多糖含量的增加對(duì)保持生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用[30]。因此， 外源蛋白的添加可以刺激多糖含量的生成， 促使生物膜的穩(wěn)定和成熟。

4?結(jié) 論

研究表明， 外源蛋白可以提高微生物細(xì)胞的疏水性， 使微生物更易附著于載體表面， 為初始生物膜的成熟提供了穩(wěn)定的基礎(chǔ)。外源蛋白與細(xì)胞表面豐富官能團(tuán)的相互作用減弱了微生物的親水性，加強(qiáng)了細(xì)胞的絮集。此外， 外源蛋白可通過(guò)刺激胞外多聚糖的分泌促進(jìn)生物膜的成熟。 污水處理廠(chǎng)出水中殘余的溶解性微生物蛋白在污水后續(xù)的運(yùn)輸和再生過(guò)程中會(huì)增加生物膜的污染， 進(jìn)而造成不利的影響。因此， 亟需對(duì)出水中的溶解性微生物蛋白進(jìn)行有效去除及控制。

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