楊 濤， 史 超， 艾尼娃爾·艾克木， 張向陽(yáng)， 迪麗努爾·買買提依明

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合心臟內(nèi)科， 烏魯木齊 830054；3新疆醫(yī)科大學(xué)臨床研究院， 烏魯木齊 830011)

高原肺動(dòng)脈高壓(high altitude pulmonary hypertension，HAPH)是指機(jī)體從平原環(huán)境進(jìn)入高海拔地區(qū)后，在缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)發(fā)生的肺血管病變，進(jìn)而導(dǎo)致肺循環(huán)阻力升高[1-3]。在HAPH形成的初期，由于供氧不足引發(fā)肺微小血管發(fā)生收縮，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，肺動(dòng)脈出現(xiàn)平滑肌細(xì)胞肥大、管壁變厚、內(nèi)徑變窄等改變，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓(PAP)逐步上升，持續(xù)升高的PAP使心臟壓力負(fù)荷逐步上升，使得右心室增大、心室壁肥厚，隨著時(shí)間的推移，機(jī)體供氧不足造成心臟組織損傷，降低心輸出量，最終引發(fā)心衰[4-5]。目前在臨床中通常采用舒張血管或松弛平滑肌藥物(如：硝苯地平、氨茶堿等)緩解PAP癥狀。毛訶子為使君子科植物毗黎勒孔[Terminaliabillerica(Gaertn.)Roxb.]的干燥成熟果實(shí)[6]，主要化學(xué)成分為三萜皂苷、強(qiáng)心苷、木脂素、鞣質(zhì)類、脂肪酸等[7]，具有抗氧化、降脂、抑菌等多種藥理作用[8-9]，研究表明由毛訶子組成的三果湯散對(duì)高原性疾病具有良好的治療作用[10-11]。本研究采用HAPH大鼠模型，探究毛訶子提取物對(duì)HAPH所致大鼠心臟損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器DW-86L338型超低溫冰箱(中國(guó)海爾公司)， Multiskan 352型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，Labsystems AC8型洗板機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，TG16W型微量高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)公司)，BL-420電生理記錄儀(中國(guó)成都泰盟公司)，ks606731型小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京科思佳公司)，西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院)。

1.2 試藥硝苯地平片(山西云鵬制藥有限公司，批號(hào) F160601)，毛訶子(新疆麥迪森維藥有限公司，批號(hào) P30001307)，大鼠EPO ELISA 試劑盒 (中國(guó)臺(tái)灣亞諾法生技公司，批號(hào) AD20180708)，大鼠C Reactive 蛋白ELISA試劑盒(上海艾博抗公司，批號(hào) GR3184775-11)，大鼠IGF-1 ELISA 試劑盒(美國(guó)安迪公司，批號(hào) P166960)，大鼠T-SOD ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào) 20180920)，大鼠MDA ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào) 20180919)，大鼠GSH-Px ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào) 20180911)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量(170±10)g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0003。

1.4 HAPH模型建立隨機(jī)選取40只SD大鼠，放置于西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(氣壓：53.9 KPa)中30 d，建立HAPH模型；剩余10只SD大鼠，放置于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心平原環(huán)境中(氣壓：92.9 KPa)，所有大鼠自由飲水進(jìn)食喂養(yǎng)30 d。

1.5 藥物的提取方法稱取毛訶子藥材1 kg，粉碎后過(guò)四號(hào)篩，用95%乙醇按照液料比1∶15 (g∶mL)、溫度60℃、時(shí)間1.5 h進(jìn)行提取，提取液經(jīng)濃縮、干燥，即得毛訶子醇提物。另稱取毛訶子藥材1 kg，粉碎后過(guò)四號(hào)篩，用蒸餾水按照液料比1∶15(g∶mL)、溫度60℃、時(shí)間1.5 h進(jìn)行提取，提取液經(jīng)濃縮、干燥，即得毛訶子水提物。

1.6 分組及給藥方法將40只HAPH模型SD大鼠隨機(jī)分為：高原肺動(dòng)脈高壓組(生理鹽水0.4 mL/100 g體質(zhì)量)、陽(yáng)性組(硝苯地平片2.7 mg/kg體質(zhì)量)、毛訶子醇提物組(毛訶子醇提物270 mg/kg體質(zhì)量)和毛訶子水提物組(毛訶子醇提物270 mg/kg體質(zhì)量)，平原環(huán)境中的10只大鼠為平原組(生理鹽水0.4 mL/100 g體質(zhì)量)，各組大鼠自由進(jìn)食飲水，連續(xù)灌胃15 d。

1.7 大鼠肺動(dòng)脈血壓的測(cè)定[12]給藥完成24 h后，采用戊巴比妥鈉將各組大鼠麻醉后，以平臥狀態(tài)固定于手術(shù)臺(tái)，打開胸腔，充分暴露肺和心臟，分離頸靜脈，插管經(jīng)右心房、右心室進(jìn)入肺動(dòng)脈，測(cè)定肺動(dòng)脈血壓，記錄血壓結(jié)果。

1.8 大鼠血清中CRP、IGF-1和EPO含量的測(cè)定各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，按試劑盒說(shuō)明方法操作，測(cè)定大鼠血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)、促生長(zhǎng)因子(IGF-1)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)的含量。

1.9 大鼠心臟組織中MDA、SOD和GSH-PX含量的測(cè)定摘取各組大鼠心臟，按照試劑盒說(shuō)明方法對(duì)心臟組織進(jìn)行處理，測(cè)定心臟組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的含量。

1.10 大鼠心臟組織病理學(xué)檢查取“1.9”項(xiàng)下大鼠心臟組織，置于固定液中固定，使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色(HE)，置于顯微觀察各組大鼠心臟組織的形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺動(dòng)脈血壓測(cè)定結(jié)果與平原組比較，高原肺動(dòng)脈高壓組、陽(yáng)性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠肺動(dòng)脈血壓升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高原肺動(dòng)脈高壓組比較，陽(yáng)性組、毛訶子醇提物組大鼠肺動(dòng)脈血壓下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽(yáng)性組比較，毛訶子水提物組、毛訶子醇提物組大鼠肺動(dòng)脈血壓升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺動(dòng)脈壓測(cè)定結(jié)果

注：與平原組比較，*P<0.05； 與高原肺動(dòng)脈高壓組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性組比較，★P<0.05。

2.2 各組大鼠血清CRP、IGF-1、EPO含量的測(cè)定結(jié)果與平原組比較,高原肺動(dòng)脈高壓組、陽(yáng)性組、毛訶子醇提、水提物組大鼠血清中CRP含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高原肺動(dòng)脈高壓組比較,陽(yáng)性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中CRP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽(yáng)性組比較, 毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中CRP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與平原組比較,高原肺動(dòng)脈高壓組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中IGF-1含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽(yáng)性組大鼠血清中IGF-1含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高原肺動(dòng)脈高壓組比較,陽(yáng)性組大鼠血清中IGF-1含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中IGF-1含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽(yáng)性組比較，毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中IGF-1含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與平原組比較,高原肺動(dòng)脈高壓組、陽(yáng)性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中EPO含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高原肺動(dòng)脈高壓組比較,陽(yáng)性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠血清中EPO含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽(yáng)性組比較,毛訶子醇提物組大鼠血清中EPO水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清中CRP、IGF-1、EPO含量的測(cè)定結(jié)果

注：與平原組比較，*P<0.05； 與高原肺動(dòng)脈高壓組比較，#P<0.05；與陽(yáng)性組比較，★P<0.05。

2.3 各組大鼠心臟病理學(xué)檢查結(jié)果平原組大鼠在低、高倍視野下可見心肌結(jié)構(gòu)均正常，心肌細(xì)胞染色清楚，細(xì)胞核致密，心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，未見顆粒樣變、嗜酸性病變細(xì)胞浸潤(rùn)等異常病變情況(圖1A，圖1B)。高原肺動(dòng)脈高壓組大鼠在低倍視野下可見心肌纖維排列混亂、橫紋不清(圖1C)，在高倍視野下可見心肌纖維呈顆粒樣病變并少量嗜酸性病變，心肌間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血，偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)。陽(yáng)性組大鼠在低倍視野下可見心肌纖維排列不規(guī)則，橫紋不清(圖1E)，在高倍視野下可見少量大鼠心肌纖維輕度顆粒樣變，偶見心肌間質(zhì)血管輕度擴(kuò)張充血(圖1F)。毛訶子醇提物組大鼠在低倍視野下可見心肌間質(zhì)血管明顯擴(kuò)張充血(圖1G)，在高倍視野下可見心肌纖維輕度腫脹，心肌細(xì)胞嗜酸性病變，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1H)。毛訶子水提物組大鼠在低倍視野下可見心肌纖維排列不規(guī)則，橫紋不清(圖1I)，在高倍視野下可見大鼠心肌纖維顆粒樣變形并少量嗜酸性病變細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血并偶見炎性浸潤(rùn)(圖1J)。

2.4 各組大鼠心臟SOD、MDA、GSH-Px的測(cè)定結(jié)果與平原組比較，高原肺動(dòng)脈高壓組、陽(yáng)性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提物組大鼠心臟中SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高原肺動(dòng)脈高壓組比較，陽(yáng)性組、毛訶子醇提物組、毛訶子水提取組大鼠心臟組織中SOD、GSH-Px活性增強(qiáng)，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽(yáng)性組比較，毛訶子醇提物、毛訶子水提物組心臟中SOD、GSH-Px活性增強(qiáng)，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

A 平原組(HE×100)

B 平原組(HE×400)

C高原肺動(dòng)脈高壓組(HE×100)

D高原肺動(dòng)脈高壓組(HE×400)

E 陽(yáng)性組(HE×100)

F陽(yáng)性組(HE×400)

G毛訶子醇提物組(HE×100)

H毛訶子醇提物組(HE×400)

I 毛訶子水提物組(HE×100)

J 毛訶子水提物組(HE×400)

圖1 各組大鼠心臟病理學(xué)檢查顯微圖

3 討論

海拔在2 500 m以上的地區(qū)稱為高原地區(qū)[13]。全球大約有超過(guò)1億人生活在高原地區(qū)，主要分布在我國(guó)的青藏高原、帕米爾高原以及南美洲的玻利維亞高原等。初次進(jìn)入高原者，由于機(jī)體持續(xù)處于缺氧狀態(tài)從而刺激外周化學(xué)感受器(頸動(dòng)脈竇)，進(jìn)而刺激呼吸中樞引起早期通氣量增加，機(jī)體可吸入更多氧氣已進(jìn)行代償，此過(guò)程稱為高原習(xí)服，即人體對(duì)高原低氧的適應(yīng)過(guò)程。當(dāng)初登高原者，發(fā)生高原習(xí)服失敗時(shí)，則會(huì)引起高原紅細(xì)胞增多癥、高原肺動(dòng)脈高壓癥[14-15]。本研究通過(guò)西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙模擬海拔5 000 m高原環(huán)境，建立高原肺動(dòng)脈高壓模型大鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與平原環(huán)境大鼠相比，高原環(huán)境大鼠肺動(dòng)脈血壓增高，給予硝苯地平干預(yù)后，肺動(dòng)脈壓降低，表明高原肺動(dòng)脈高壓大鼠模型建立成功。

表3 各組大鼠心臟SOD、MDA、GSH-Px的測(cè)定結(jié)果

注：與平原組比較，*P<0.05； 與高原肺動(dòng)脈高壓組比較，#P<0.05； 與陽(yáng)性組比較，★P<0.05。

活性氧(ROS)為一類廣泛存在生物體中富含有氧元素的物質(zhì)，并且具有活潑的性質(zhì)，如：激發(fā)態(tài)的氧分子、過(guò)氧化物、含氧自由基[16]。在正常機(jī)體內(nèi)，ROS的產(chǎn)生和消耗維持在平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到某些內(nèi)因或者外部因素刺激后，機(jī)體發(fā)生代謝紊亂，使ROS產(chǎn)生過(guò)多或利用減少，過(guò)剩的ROS可造成細(xì)胞膜氧化損傷，最終導(dǎo)致多種組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。有證據(jù)表明，高原環(huán)境下帶來(lái)的低氧誘導(dǎo)了ROS的過(guò)載[17]，過(guò)載的ROS最終導(dǎo)致HPH的發(fā)生[18]。當(dāng)機(jī)體暴露于高海拔環(huán)境中時(shí)，血液中含氧量下降，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化損傷產(chǎn)物蛋氨酸亞砜、MDA等的含量增加， SOD、GSH-Px等內(nèi)源性抗氧化酶活性降低。本研究結(jié)果顯示，高原肺動(dòng)脈高壓組大鼠心肌內(nèi)SOD、GSH-Px活性減弱，MDA的含量增加，這表明HAPH大鼠處在氧化應(yīng)激狀態(tài)，并且出現(xiàn)心臟的損傷。給予毛訶子(醇、水)提取物進(jìn)行干預(yù)，HAPH大鼠心組織內(nèi)SOD、GSH-Px活性增強(qiáng)， MDA的含量降低，這表明不同溶媒毛訶子的提取物，均可改善HAPH大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，減輕心臟的氧化損傷程度。

機(jī)體長(zhǎng)期處于高海拔區(qū)域，慢性低氧會(huì)直接刺激機(jī)體系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生。CRP[19]是重要的炎癥介質(zhì)，其水平不僅可作為組織受損程度的判斷依據(jù)，還可以作為心血管疾病的危險(xiǎn)因子。同時(shí)，CRP可通過(guò)直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)ET-1 的分泌，降低NOS的水平，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂使肺血管痙攣從而參與HAPH的形成。促紅細(xì)胞生成素(EPO)為機(jī)體中內(nèi)源性糖蛋白激素[20]，可促使紅細(xì)胞產(chǎn)生。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于高原環(huán)境時(shí)，低氧能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生大量EPO，與靶器官結(jié)合后，可通過(guò)激活JAK2及STAT-5相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)紅細(xì)胞大量增殖，導(dǎo)致血液黏稠度增加、微循環(huán)障礙、血栓的形成、廣泛的臟器損傷。IGF-1亦被稱作促生長(zhǎng)因子，是一類蛋白多肽，是一種具有心血管保護(hù)作用的細(xì)胞因子[21]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可通過(guò)多種途徑，舒張血管、消除多余氧自由基等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HAPH大鼠血清中CRP 、EPO含量升高，IGF-1含量降低，給予毛訶子水提取物、醇提取物干預(yù)后，大鼠血清中以上指標(biāo)都趨向正常水平,表明毛訶子水提取物、醇提取物對(duì)HAPH大鼠的心臟損傷具有保護(hù)作用。