施 雅

(上海必諾檢測技術(shù)服務有限公司，上海 200436)

草銨膦(glufosinate)的化學名稱為：DL-甲基-(3-氨基-3-羧基丙基)膦酸銨,是拜耳公司研究開發(fā)的具有部分內(nèi)吸作用的非選擇性、觸殺性除草劑，是高效、低毒、大噸位使用的旱地除草劑[1]。作為除草劑，草銨膦幾乎能有效除去各種供試雜草，并且對農(nóng)作物安全，藥害小，是目前轉(zhuǎn)基因抗性作物理想的除草劑，應用前景廣闊[2-4]。盡管草銨膦屬于非持久性農(nóng)藥，但大量和過量使用仍有可能在農(nóng)作物上農(nóng)藥殘留，從而對人類健康產(chǎn)生嚴重危害和影響[5-6]。目前包括歐盟、美國、日本、加拿大、中國等國均對草銨膦均提出了最大限量要求，限量范圍在0.02～8 mg/kg[7]。

草銨膦的檢測方法主要包括液相色譜法[8-9]、離子色譜法[10]、毛細管電泳法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等等。本實驗采用UPLC-MS/MS法，UPLC-MS/MS結(jié)合了色譜的分離技術(shù)的和質(zhì)譜的高選擇性，加入同位素內(nèi)標消除基質(zhì)效應，柱前衍生提高質(zhì)譜響應值，實現(xiàn)了對于蘋果、哈密瓜、青菜、白菜四種果蔬中草銨膦殘留的快速檢測。該方法試劑成本低，結(jié)果準確、操作簡便，靈敏度高，能夠滿足四中果蔬中草銨膦的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純，國藥集團；甲酸、乙酸銨：優(yōu)級純，國藥集團；FOMC-Cl、四硼酸鈉：分析純，美國 Sigma公司；草銨膦標準品：純度﹥97.5%，購自Dr.Ehrenstorfer公司；草銨膦-d3標準品：純度﹥99% ，加拿大TRC公司。標準溶液配制：稱取適量標準品，用水溶解，標準儲備溶液濃度為1.0 mg/mL。 0～4℃冷藏避光保存。上述儲備液0.1 mL，用水定容至10 mL，溶液濃度為10 μg/mL的標準工作溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

內(nèi)標溶液配制：稱取適量標準品，用水溶解，儲備液溶液濃度為100 μg/mL。0～4℃冷藏避光保存。去上述儲備液1 mL，用水定容至10 mL，溶液濃度為10 μg/mL的標準工作溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.1.2 儀器設備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源，美國安捷倫公司；勻漿機：JJ-2型，金壇市城西崢嶸實驗儀器廠；高速冷凍離心機：Sorvall ST16R型，賽默飛世爾公司；渦旋震蕩器：Basic Vortex Mixer型，美國Talboys公司；氮吹儀：ANPEL DC12型，上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

提?。悍Q取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入40 μL 10 μg/mL的d3-草銨膦同位素內(nèi)標和10 mL水，震蕩提取30 s，用勻漿機在15000 r/min，勻漿提取1 min，于8000 r/min離心5 min，取上清液5 mL至8 mL，待凈化。

凈化：C18小柱經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水活化后，將上述提取液正向通過C18小柱，棄去前2 mL洗脫液，收集后3 mL至5 mL流出液，待衍生。

衍生：取上述凈化后提取液600 μL，加入200 μL 1.0 mg/mL FMOC-Cl丙酮溶液和200 μL 30 g/L四硼酸鈉溶液，混勻，室溫下進行衍生化反應，放置過夜。過0.22 μm水相濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

標準液衍生：取適量混合標準溶液600 μL，加入200 μL 1.0 mg/mL FMOC-Cl丙酮溶液和200 μL 30 g/L四硼酸鈉溶液，混勻，室溫下進行衍生化反應，放置過夜，過0.22 μm水相濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：Eslipse plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm粒徑)；流動相：0.1%甲酸水溶液(v/v)+乙腈(梯度洗脫見表1)；流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：3.0 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.2.3 串聯(lián)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應檢測；霧化器溫度：350℃霧化器流量：12 L/min；鞘氣溫度：400℃；鞘氣流量：12 L/min；定性、定量離子對及對應的碎裂電壓和碰撞能量見表2。

表2 草銨膦的質(zhì)譜參數(shù)

注：a 定量離子。對于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。

2 結(jié)果討論

2.1 凈化方法的優(yōu)化

實驗比較了C18固相萃取柱、MCX固相萃取柱、HLB對草銨膦回收率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，C18固相萃取柱的凈化效果好。MCX、HLB在正相凈化過程中吸附了部分目標化合物，導致了目標化合物回收率的不穩(wěn)定和下降。C18填充物為非極性物質(zhì)，對于強極性草銨膦吸附性弱，并且能夠有效分離目標化合物和雜質(zhì)，所以選擇C18固相萃取柱凈化樣品。

圖1 固相萃取柱對凈化效果的影響

2.2 分析方法線性范圍考察

分別選取蘋果、哈密瓜、青菜和白菜四種樣品，按照前處理方法，采用所得到的基質(zhì)溶液配制標準曲線，標準曲線濃度分別為0 ng/mL、10～500.0 ng/mL，再經(jīng)過衍生，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，以標準溶液中被測組分峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，以被測組分濃度為橫坐標，繪制標準曲線，在四種基質(zhì)中草銨膦相應的回歸方程及相關系數(shù)見表3。

表3 草銨膦在四種果蔬基質(zhì)加標的回歸方程和相關系數(shù)

由表3可知，在0～500 ng/mL范圍內(nèi)草銨膦濃度與其色譜峰面積響應值呈良好的線性關系。草銨膦標準溶液的多級反應監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖2。由圖2表明，10 ng/mL的草銨膦響應值良好。

圖2 草銨膦標準品的MRM色譜圖

Fig.2 MRM chromatogram of glufosinate standards

2.3 準確度和精密度

按本方法確定的條件，選擇蘋果、哈密瓜、青菜、白菜四種果蔬作為基質(zhì)樣品，進行50、100、500 μg/kg三個水平的添加回收試驗，各水平進行6次平行測定，回收率和精密度見表4。

表4 草銨膦在不同果蔬中加標回收率及精密度測定結(jié)果

由表4可知，在這四種果蔬中添加不同含量的草銨膦，其平均回收率達到85.5%～97.4%，相對標準偏差小于10%，表明該方法對不同樣品和不同含量的草銨膦的測定均具有很好的準確度和精密度。

3 結(jié)論

本實驗建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定四種果蔬中草銨膦的檢測方法。草銨膦屬于強極性化合物，采用純凈水提取，經(jīng)過C18固相萃取柱凈化，消除了色素、脂類物質(zhì)的干擾，經(jīng)過衍生后，再應用Agilent Eclipse plus C18色譜柱分離，采用多反應監(jiān)測模式，電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進行檢測，內(nèi)標法定量，實現(xiàn)了對草銨膦定性、定量測定。該檢測方法成本低廉、方法簡單、快速、定性定轉(zhuǎn)準確，能夠滿足四中果蔬中草銨膦殘留的檢測。