陳敏兒，黃啟紅，熊 娟，伍玲燕，黃璇瑩，張?jiān)讫?，周小?/p>

(廣東省測試分析研究所，廣東 廣州 510000)

1 原理

葉酸 (Folic Acid)是人體必需的維生素之一，可以促進(jìn)骨髓中幼細(xì)胞成熟,人體若缺乏葉酸可引起貧血、腸胃功能紊亂、智力下降等問題，補(bǔ)充過量又會(huì)干擾人體鋅代謝，增加下一代患自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)等情況出現(xiàn)。因而對于維生素補(bǔ)充劑的葉酸含量的檢測監(jiān)測十分重要。國標(biāo)法(GB 5009.211-2014)原理是利用鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus對葉酸的特異性,在一定控制條件下將菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)一段時(shí)間后測定吸光度根據(jù)葉酸含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中葉酸的含量。試劑盒法是將試樣液和葉酸檢測培養(yǎng)基加入預(yù)包被有Lactobacillusrhamnosus的微孔中，Lactobacillusrhamnosus的生長狀況取決于葉酸的含量。添加葉酸作為標(biāo)準(zhǔn)或者作為樣品混合物，細(xì)菌會(huì)一直生長直至葉酸被消耗殆盡。

本文采用兩種方法對3種維生素膠囊中葉酸含量檢測,對比兩種方法的差異性。試驗(yàn)方案及結(jié)果如下。

2 試劑、設(shè)備與方法

2.1 試劑

乙醇(廣州化學(xué)試劑廠)；氫氧化鈉(廣州化學(xué)試劑廠)；葉酸測定培養(yǎng)基(北京陸橋)；微生物法定量檢測葉酸試劑盒(VitaFast)；磷酸二氫鈉(廣州化學(xué)試劑廠)；抗壞血酸(廣州化學(xué)試劑廠)；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)；0.22 μm無菌過濾器(Sartorius Stedim)。

2.2 儀器和設(shè)備

KQ-800型超聲波清洗器(昆山超聲儀器)；1900培養(yǎng)箱(BioCELL)；WTS-2000紫外分光光度計(jì)(上海慧多)；HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒)；BSC-1000ⅡA2生物安全柜(蘇凈安泰)； 800TS酶標(biāo)檢測儀(Biotek)；JJ200B電子天平(G&G)。

2.3 方法

2.3.1 國標(biāo)法(GB 5009.211-2014)

2.3.1.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取0.5 g維生素膠囊內(nèi)容物到100 mL錐形瓶中，加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲2～4 h至樣品完全溶解或分散，用水定容至刻度。根據(jù)樣品中葉酸含量對提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

2.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

取試管依表1分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0.2 ng/mL)和無菌水，再加入5.0 mL葉酸測定用培養(yǎng)液，混勻。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備(國標(biāo)法)

2.3.1.3 培養(yǎng)基制備

依照標(biāo)準(zhǔn)將葉酸測定培養(yǎng)基與葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液或樣品稀釋液混勻，加塞，高壓滅菌。

2.3.1.4 培養(yǎng)

待測定系列管冷卻至室溫后，在無菌操作條件下，用滅菌的移液管分別加20 μL接種液，混勻，加塞，在 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～40 h，直至獲得最大混濁度。另準(zhǔn)備一支S1管不接種作為0對照管。

2.3.1.5 測定

將培養(yǎng)后的測定系列管混勻，用1 cm厚度的比色杯，波長540 nm，以0對照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，依次測定標(biāo)準(zhǔn)系列管和樣品系列管的吸光度值。若有以下情況時(shí)，說明存在污染，需重做試驗(yàn)：

0對照管有明顯細(xì)菌增長，混濁；

與0對照管相比，標(biāo)準(zhǔn)0管吸光度值在0.1以上；

標(biāo)準(zhǔn)系列管吸光度值最大變化量<0.4。

2.3.1.6 結(jié)果計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)系列管葉酸含量為橫坐標(biāo)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的吸光度值平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品結(jié)果計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品系列管的葉酸對應(yīng)含量，按公式計(jì)算結(jié)果(詳見標(biāo)準(zhǔn))。

2.3.2 試劑盒法

2.3.2.1 樣品制備

稱取1 g維生素膠囊內(nèi)容物到500 mL離心管中，加入約400 mL磷酸鹽緩沖液(7.8 g磷酸二氫鈉和1 g抗壞血酸鈉溶解于1L蒸餾水中，校正pH值至7.2；每天新配緩沖液)，搖勻。95℃水浴提取30 min，其間振蕩至少5次，迅速冷卻到30℃以下。將提取溶液全部加入到1000 mL容量瓶中，用無菌水準(zhǔn)確定容至刻度。取1 mL溶液至一個(gè)50 mL無菌試管中，加無菌水精確至40 mL。然后搖勻，無菌過濾，根據(jù)濃度范圍，確定是否在1.5 mL(或2.0 mL)無菌試管中進(jìn)一步稀釋。

2.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

打開試劑盒中的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品瓶，添加X mL(X=詳見標(biāo)準(zhǔn)品瓶)無菌水(取自試劑盒)至標(biāo)準(zhǔn)品瓶中。蓋上標(biāo)準(zhǔn)品瓶蓋，搖勻稀釋=標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液。取6個(gè)無菌管(1.5～2.0 mL)，并按照表2準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備(試劑盒法)

注：*樣品提取稀釋倍數(shù) 1∶40 已經(jīng)包含在標(biāo)準(zhǔn)曲線中。

2.3.2.3 培養(yǎng)基制備

取出試劑盒中的培養(yǎng)基，打開瓶蓋用鑷子取出干燥劑，加入10 mL無菌水(取自試劑盒)至葉酸培養(yǎng)基瓶中，加入1 mL葉酸緩沖液至培養(yǎng)基瓶。蓋好培養(yǎng)基瓶，搖勻。水浴加熱該瓶至95℃保持5 min，其間振蕩至少2次，并確保瓶子封閉。迅速冷卻至室溫。使用0.22 μm無菌濾膜過濾培養(yǎng)基至15 mL無菌離心管中。

2.3.2.4 培養(yǎng)

微孔板實(shí)驗(yàn)中必須使用無菌水稀釋的無菌樣品，無菌水取自試劑盒。

移液器先移取培養(yǎng)基，之后標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋的樣品，如下：

-移取150 μL葉酸培養(yǎng)基至微孔中。

-移取150 μL標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋的樣品至指定的微孔中(用標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液沖洗移液器尖)。

-用粘合箔蓋住板條或微孔，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。

-在 37℃黑暗條件下孵育44～48 h。

2.3.2.5 測定

再次壓緊粘合箔，將微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養(yǎng)基中。

將微孔板翻回如前置于桌面上，從右上角開始以對角線方向180°角輕扯下粘合箔，與此同時(shí)務(wù)必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔與微孔板粘合過緊而在撕扯時(shí)帶起微孔板。破壞微孔中液體表面的所有泡沫(可以用移液管尖或針狀物)。

用酶標(biāo)儀610～630 nm(或540～550 nm)條件下讀取吸光度。

判定檢測結(jié)果有效：

-OD空白值

-OD標(biāo)準(zhǔn)5>0.6 OD。

2.3.2.6 計(jì)算結(jié)果

計(jì)算結(jié)果時(shí)使用拜發(fā)公司提供的配套的RIDA?SOFT Win軟件。

樣品稀釋倍數(shù)40已經(jīng)包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線中。在下面的公式中，只需要考慮提取的進(jìn)一步稀釋倍數(shù)及不同的樣品重量。

3 結(jié)果比對

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

兩個(gè)方法均是以葉酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。國標(biāo)法(GB 5009.211-2014)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線采用EXCEL軟件繪制多項(xiàng)式曲線，曲線及方程如圖1，決定系數(shù)R2=0.998；試劑盒法試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線采用RIDA?SOFT Win軟件生成，如圖2，相關(guān)系數(shù)=0.9995。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(國標(biāo)法)

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(試劑盒法)

3.2 結(jié)果重復(fù)性

選取3種已知葉酸含量范圍的維生素膠囊A、B、C，取膠囊內(nèi)容物依2.3.1.1和2.3.2.1分別平行制備6份樣品溶液，測定樣品溶液中葉酸的濃度，以所得的樣品中葉酸的濃度來計(jì)算RSD，RSD應(yīng)≤4%。

所得結(jié)果如表3。

表3 兩種方法試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性比對

3.3 加標(biāo)回收率

取維生素膠囊A、B、C的內(nèi)容物各12份，每6份同一樣品為一組，分為Ⅰ、Ⅱ組。Ⅰ組按國標(biāo)法測試，Ⅱ組按試劑盒法測試。

AⅠ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入161 μg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入此溶液160 μL，即加入相當(dāng)于161 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.1.1處理，作為供試品溶液A。按2.3.1所述測試，計(jì)算回收率和RSD。

AⅡ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入283 μg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入此溶液280 μL，即加入相當(dāng)于283 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.2.1處理，作為供試品溶液B。按2.3.2所述測定，計(jì)算回收率和RSD。

BⅠ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入151 μg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入此溶液150 μL，即加入相當(dāng)于151 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.1.1處理，作為供試品溶液A。按2.3.1所述測試，計(jì)算回收率和RSD。

BⅡ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入212 μg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入此溶液210 μL，即加入相當(dāng)于212 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.2.1處理，作為供試品溶液B。按2.3.2所述測定，計(jì)算回收率和RSD。

CⅠ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入60.5 μg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入此溶液60 μL，即加入相當(dāng)于60.5 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.1.1處理，作為供試品溶液A。按2.3.1所述測試，計(jì)算回收率和RSD。

CⅡ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入111 μg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入此溶液110 μL，即加入相當(dāng)于111 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.2.1處理，作為供試品溶液B。按2.3.2所述測定，計(jì)算回收率和RSD。

回收率應(yīng)為85%～110%，RSD應(yīng)≤4%。

備注：

樣品所含葉酸質(zhì)量=樣品依對應(yīng)的測試方法測得的葉酸平均值(見表5)×取樣量(g)

測得加入葉酸質(zhì)量=測得總?cè)~酸質(zhì)量-樣品所含葉酸質(zhì)量

回收率=測得加入葉酸的質(zhì)量÷加入葉酸的質(zhì)量×100%

所得結(jié)果如表4。

表4 兩種方法加標(biāo)回收率測試結(jié)果

4 結(jié)論

在本次針對維生素膠囊葉酸含量的方法比對中，從測試結(jié)果可看出，國標(biāo)法和試劑盒法的重復(fù)性均良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均≤4%。在精密度上，國標(biāo)法的回收率在100%～105%，RSD在2%～4%，符合要求(回收率85%～110%，RSD≤4%)；試劑盒法AⅡ、CⅡ組符合要求，BⅡ組回收率僅78.5%，RSD>4%，超出要求范圍；Ⅰ組(國標(biāo)法)的回收率均高于Ⅱ組(試劑盒法)。結(jié)果顯示，國標(biāo)法比試劑盒法更適合檢測維生素膠囊葉酸含量。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程的觀察(維生素膠囊B內(nèi)容物按試劑盒法制備的樣品液溶解情況較差)，推測可能是國標(biāo)法的樣品制備方法相比試劑盒法的樣品制備方法更適合該膠囊。

此外，在實(shí)驗(yàn)過程中，試劑盒法相比國標(biāo)法，無需活化菌種，培養(yǎng)基用量少，步驟簡單，污染概率低，是比較方便快捷的微生物法；國標(biāo)法從菌種活化到測吸光度值所需時(shí)間周期長，易受雜菌或雜質(zhì)影響?；蚩蓢L試將國標(biāo)法的樣品制備法與試劑盒法結(jié)合測試。

本次比對國標(biāo)法試驗(yàn)中，采用帶蓋的一次性試管，發(fā)現(xiàn)比使用重復(fù)使用的玻璃試管測試結(jié)果更穩(wěn)定，污染概率大大降低。