楊帥 劉琴 萬傳星

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

1 前言

放線菌素D（Actinomycin D）是上世紀(jì)40年代Waksman首次從微小鏈霉菌Streptomyces parvullus中分離得到的多肽類抗生素［1]，具有抗菌、抗腫瘤、抗癌和抗病毒作用［2]。目前文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)放線菌素D的菌株有微小鏈霉菌S.parvulus，哥斯達(dá)黎加鏈霉菌S.costaricanus，公牛鏈霉菌S.tauricus，灰紅鏈霉菌S.griseoruber，抗生鏈霉菌S.rubiginosohelvolus，銹赤蠟黃鏈霉菌S.rubiginosohelvolus，黃灰鏈霉菌S.flavogriseusNJ-4等［3-8]。黃色鏈霉菌Streptomyces luteusTRM 45540是本課題組分離自新疆羅布泊土壤的放線菌，其主要次生代謝產(chǎn)物為放線菌素D［9]，前期命名為易變鏈霉菌Streptomyces mutabilisTRM 45540，后經(jīng)全基因組測(cè)序和多相分類鑒定為S.luteus［10]。啟動(dòng)子插入或替代是提高抗生素產(chǎn)量的常用方法之一，如尹守亮等在龜裂鏈霉菌M4018宿主內(nèi)利用強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)OtcR蛋白，使土霉素的產(chǎn)量提高到原來產(chǎn)量的4倍［11]；周威等用紅霉素啟動(dòng)子(ermE*P1)替換波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前體肽合成基因btmD啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了波卓霉素的產(chǎn)量提高［12]；陶立彬等利用PermE*啟動(dòng)子提高了淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌豐加霉素的產(chǎn)量［13]。本實(shí)驗(yàn)擬通過接合轉(zhuǎn)移方法將強(qiáng)啟動(dòng)子A4隨機(jī)插入整合在黃色鏈霉菌Streptomyces luteusTRM 45540基因組上，考察其對(duì)放線菌素D產(chǎn)量的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

黃色鏈霉菌 TRM 45540（Streptomyces luteus）菌株，由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

質(zhì)粒pSET152和大腸桿菌Escherichia coliS17-1，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉琴博士提供。

LB培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0；

ISP4培養(yǎng)基 (1 L)：可溶性淀粉 10 g，K2HPO41 g，MgSO4·7 H2O 1.0 g，(NH4)2SO44.0 g，CaCO31.0 g，瓊脂粉 18 g，pH 7.0～ 7.5；

燕麥-豆粉培養(yǎng)基(1 L)：燕麥片30.0 g，大豆粉15.0 g，NaCl 19.0 g，K2HPO41.5 g，MgSO4.7H2O 2.5 g；

Modified-ISP4(1 L)：可溶性淀粉 10 g，K2HPO41.0 g，NaCl 1.0 g ，(NH4)2SO42.0 g，CaCO32.0 g，酵母提取物0.5 g，蛋白胨1 g，MgSO4.7H2O 1.0 g，無機(jī)鹽溶液 1 mL/L，瓊脂20 g；無機(jī)鹽溶液：FeSO41 g/L，MnCl21 g/L，ZnSO41 g/L，使用前溶化后添加MgCl2至終濃度為10 mM。

2.1.2 主要儀器和試劑

儀器：潔凈工作臺(tái)（Air Tech型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；恒溫?fù)u床（HYG-A型，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；高效液相色譜儀（LC-20AT型，日本島津公司），配有二元梯度泵和SPD-20A紫外檢測(cè)器。色譜柱：C18柱（Inertsil ODS-SP 4.6 mm×250 mm，5 μm）。

試劑：阿伯拉抗生素、萘啶酮酸購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PCR用相關(guān)試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，放線菌素D（純度大于99.0%）由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，其余試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

2.2 方法

2.2.1 大腸桿菌Escherichia coliS17-1感受態(tài)的制備及DNA轉(zhuǎn)化

感受態(tài)細(xì)胞的制備：（1）挑取平板上的E.coliS17-1單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃，220 r/min，16 h；（2）將過夜培養(yǎng)的菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)入含50 mL LB三角瓶中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)2.5 h左右，直至OD=0.6 ；（3）收集菌體，5 000 r/min，10 min；（4）加入25 mL TFBI重懸菌體，5 000 r/min，4 min，棄上清；（5）在菌體中加入2 mL TFBII重懸菌體，并分裝100 μL/離心管，放于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

DNA的轉(zhuǎn)化：從-80℃取一支100 μL感受態(tài)細(xì)胞在冰上放置5 min，加入5 μL酶連產(chǎn)物或2 μL質(zhì)粒，繼續(xù)在冰上放置30 min。37℃熱激2 min或42℃熱激90 s，然后在冰上放置5 min。加入1 mL LB培養(yǎng)基，在37℃搖床中以200 r/min培養(yǎng)45 min。5 000 r/min離心3 min，倒掉大部分上清，用余下的上清將沉淀懸浮。涂布加有相應(yīng)抗性的平板，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

2.2.2 轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建

以質(zhì)粒pLQ 007+A4為模板擴(kuò)增A4片段，擴(kuò)增啟動(dòng)子A4引物序列為：

引 物 pA4up：AAAAGGATCCGACACATCCTCCAGCTGAG

引物 pA4down：AAAATCTAGAGGACCACCAGTAAGAGCTGCGA

凝膠回收A4片段，用XbaI+BamHI酶切回收A4片段，提取pSET152的質(zhì)粒DNA，用XbaI+BamHI酶切質(zhì)粒DNA，脫磷處理后與A4片段進(jìn)行連接；然后轉(zhuǎn)入E.coliS17-1感受態(tài)細(xì)胞中，形成轉(zhuǎn)化子pYS001（圖1）.

圖1 pYS001質(zhì)粒構(gòu)建圖譜

2.2.3 接合子的構(gòu)建

將pYS001接種在10 mL LB（Apr）培養(yǎng)基中，37℃，16 h；轉(zhuǎn)接培養(yǎng)了16 h的轉(zhuǎn)化子，以1%的接種量接種到新鮮的LB（Apr）培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)2.5-3 h，直至OD=0.6（600 nm）；取新鮮的孢子懸液100 μL，用TSB清洗3次，5 000 r/min，4 min；完成后加入100 μL TSB懸浮，55 ℃，10 min，37 ℃，3 h；將重新轉(zhuǎn)接的轉(zhuǎn)化子懸液，收集2次，12 000 r/min，1 min，用 LB 清洗 3 次，5 000 r/min，4 min，加入100 μL LB，于 100 μL 的孢子懸浮液混勻，放置5 min，將共培養(yǎng)的產(chǎn)物涂布于Modified-ISP4平板中，30℃培養(yǎng)12～14 h；對(duì)平板進(jìn)行抗生素覆蓋處理，覆蓋抗生素溶液配方為1 mL超純水、25 μL Nal、25 μL Apr。置于操作臺(tái)吹干后，30 ℃，培養(yǎng)5～7 d。一周后挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，提取接合子和TRM 45540菌株的總DNA，PCR驗(yàn)證A4片段是否成功導(dǎo)入TRM 45540體內(nèi)。

2.2.4 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

將提取的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，使用HindIII和BamHI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，體系如下：DNA 5 μL，10×fast Didest buffer 2 μL，HindIII 1 μL，BamHI 1 μL，ddH2O 11 μL。

2.2.5 轉(zhuǎn)化子和接合子PCR驗(yàn)證

反應(yīng)體系（20 μL）：上游引物（10 μM）0.5 μL；下游引物（10 μM）0.5 μL；模版（約 30 ng/μL）0.5 μL；Buffer（10μL,含 Mg2+）2 μL；dNTPs（2.5 mM）2 μL；DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5μL；ddH2O 14 μL。

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性，95℃，10 min；變性94 ℃，30 s；復(fù)性，58 ℃，30 s；延伸，72 ℃，1 min。變性-復(fù)性-延伸，循環(huán)30次；終延伸72℃，10 min。

2.2.6 菌株培養(yǎng)發(fā)酵及前處理流程

采用ISP4培養(yǎng)基制備接合子菌株S.luteusTRM 45540：：pYS001和野生菌株S.luteusTRM 45540種子液，裝液量150 mL/瓶、28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3天后，按4%接種量接種到燕麥-豆粉培養(yǎng)基中發(fā)酵，裝液量150 mL/瓶、28℃、180 r/min的搖床培養(yǎng)7天。每隔24 h取5 mL發(fā)酵液，50℃烘干后甲醇反復(fù)提取，定容到5 mL進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)分析。

2.2.7 HPLC法檢測(cè)放線菌素D含量［14]

放線菌素D標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為10.0 mg/mL的母液，倍性稀釋成系列濃度，HPLC流動(dòng)相為0～40 min,10%～100%甲醇，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為443 nm，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。放線菌素D的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=（1.687 6×10-6）x+0.038 9，方程中x是峰面積，y是放線菌素D含量，R2值為0.999 6，放線菌素D的含量與峰面積呈良好線性關(guān)系，可用于放線菌素D的含量分析。

圖2 放線菌素D的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)果與分析

3.1 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證

提取轉(zhuǎn)化子pYS001質(zhì)粒，利用XbaI+BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物葡聚糖凝膠電泳圖參見圖3。由圖3可知，轉(zhuǎn)化子pYS001質(zhì)粒中含有A4片段。

圖3 轉(zhuǎn)化子pYS001質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

3.2 轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物驗(yàn)證

提取轉(zhuǎn)化子pYS001總DNA并以其為模板，利用啟動(dòng)子A4（524bp）的一對(duì)引物pA4up與pA4down進(jìn)行 PCR，所用 PCR條件為 94，10 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行葡聚糖凝膠電泳分析（參見圖4），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子pYS001的PCR產(chǎn)物中含有A4片段，表明轉(zhuǎn)化成功。

圖4 轉(zhuǎn)化子pYS001 PCR產(chǎn)物驗(yàn)證

3.3 接合子S.luteusTRM 45540::pYS001中啟動(dòng)子A4的PCR驗(yàn)證

對(duì)接合轉(zhuǎn)移獲得的接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行阿伯拉抗生素（Apr）和萘啶酮酸（Nal）篩選，獲得穩(wěn)定遺傳的接合子S.luteusTRM 45540：：pYS001，以接合子總DNA為模板，利用啟動(dòng)子A4（524 bp）的一對(duì)引物pA4up與pA4down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析（參見圖5），結(jié)果表明啟動(dòng)子A4成功導(dǎo)入接合子中并能穩(wěn)定遺傳。

圖5 接合子S.luteusTRM 45540::pYS001中啟動(dòng)子A4的PCR驗(yàn)證

3.4 接合子S.luteusTRM 45540::pYS001與野生菌株S.luteusTRM 45540發(fā)酵產(chǎn)物放線菌素D的比較分析

接合子S.luteusTRM 45540：：pYS001和野生菌株TRM 45540經(jīng)燕麥-豆粉培養(yǎng)基發(fā)酵7 d后進(jìn)行放線菌素D的HPLC分析和含量動(dòng)態(tài)檢測(cè)（如圖6、圖7所示），接合子S.luteusTRM 45540：：pYS001發(fā)酵7d后產(chǎn)放線菌素D的量為821.8 mg/L，明顯高于原始菌株TRM 45540放線菌素D的產(chǎn)量（647.6 mg/L），說明啟動(dòng)子A4促進(jìn)了黃色鏈霉菌TRM 45540產(chǎn)放線菌素D的產(chǎn)量。

圖6 S.luteusTRM 45540與S.luteusTRM 45540::pYS001發(fā)酵產(chǎn)物443nm波長(zhǎng)下HPLC圖

圖7 S.luteusTRM 45540與S.luteusTRM 45540::pYS001產(chǎn)放線菌素D的曲線

4 討論與結(jié)論

放線菌素D（又稱更生霉素）是具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種活性的酯環(huán)肽類抗生素，其作用機(jī)理為嵌合于DNA雙鏈內(nèi)，抑制DNA依賴的RNA聚合酶活性，干擾細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，從而抑制mRNA合成，盡管由于其毒性較高限制了放線菌素D的使用，但放線菌素D卻是治療霍奇金病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、絨毛膜上皮癌和橫紋肌肉瘤等惡性腫瘤的特效藥，還可提高腫瘤對(duì)放射治療的敏感性，臨床上有一定的需求，所以一直有放線菌素D高產(chǎn)菌株的報(bào)道，如灰紅鏈霉菌Streptomyces griseoruber放線菌素D的產(chǎn)量為210 mg/L［15]，紅樹林鏈霉菌Stremptmeces costaricanus產(chǎn)量報(bào)道為 300 mg/L［16]；兩株耐堿放線菌Streptomyces sindenensis放線菌素D的產(chǎn)量分別為120 mg/L和850 mg/L［17]，黃灰鏈霉菌Streptomyces flavogriseusNJ-4放線菌素D的產(chǎn)量最高，為960 mg/L［18]。本實(shí)驗(yàn)通過接合轉(zhuǎn)移的策略，導(dǎo)入強(qiáng)啟動(dòng)子A4對(duì)TRM 45540進(jìn)行分子改造，使黃色鏈霉菌S.luteusTRM 45540放線菌素D的產(chǎn)量提高到821.8 mg/L，在放線菌素D的制備上具有一定的應(yīng)用潛能。