丁善航 綜述 修典榮 審校

(北京大學第三醫(yī)院普通外科，北京 100191)

胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)預后很差，大多數(shù)患者診斷時已失去手術機會[1]，選擇合適的腫瘤標志物對胰腺癌患者進行預后評估有助于選擇及調整治療方案以使患者生存獲益，但目前胰腺癌尚缺少相關的高特異性和靈敏性的生物標記物。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，通過相關檢測手段可在血液循環(huán)中檢測到[2]。CTCs表達水平的高低與腫瘤惡性程度、輔助治療療效及預后相關，具有作為腫瘤特異性標記物的潛在價值[3～5]，但在循環(huán)中含量很少，難以被富集，成為限制研究的瓶頸。近年來，隨著CTCs檢測技術的不斷進步，CTCs 作為腫瘤生物標志物進行預后評估的研究逐漸成為熱點[6]。本文就CTCs主要的富集、鑒定方法及其在胰腺癌預后評估價值的相關研究做文獻總結。

1 CTCs的富集和鑒定

1.1 CTCs的富集

CTCs在循環(huán)中分布和取樣的部位有外周血和門靜脈，外周血常用的取樣部位有肘靜脈、足背靜脈等，由于取材方便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點，目前大部分CTCs研究采取該方式，但外周循環(huán)中CTCs數(shù)量極少，通常為0～102/ml[7，8]，對分離富集技術要求較高。對CTCs進一步的富集需要利用CTCs與血細胞在特定參數(shù)上的差異而篩選出CTCs，主要分為基于物理學特征和免疫學特征的富集方法兩大類。由于富集純度高以及保持細胞活性等方面優(yōu)勢，免疫學富集方法相較于傳統(tǒng)物理學富集方法應用更為廣泛，但物理學富集方法仍具有特有優(yōu)勢。

1.1.1 基于物理學特征的富集方法

密度梯度離心法利用分離介質及高速離心使存在密度差異的細胞群落分層從而分離富集CTCs，該方法富集CTCs的過程不受細胞表面標志物下調的影響，可獲得較高的檢出率。Buscail 等[9]對比密度梯度離心法和免疫學原理的RosetteSep系統(tǒng)的檢測效率，結果顯示密度梯度離心法更可靠，CTCs采收率為(56±23)%，明顯高于RosetteSep系統(tǒng)采收率(39±27)%(P<0.001)。但該方法相對其他方法富集CTCs的純度較低，活性較弱，限制了其使用。

膜濾過富集法利用CTCs直徑大于其他血細胞的特點，通過濾膜過濾將CTCs與其他細胞分離而進行富集，常用的MetaCell、ISET系統(tǒng)即利用血樣通過孔徑為8 μm的高分子材料聚碳酸脂膜來過濾、分離、富集CTCs。該類方法能夠較好地保持細胞原有形態(tài)，同時較少受CTCs表型改變的影響[10]，具有較高的富集性能[11]，但易混雜其他血細胞導致富集純度偏低。

1.1.2 基于免疫學特征的富集方法

免疫學富集方法是利用CTCs和血細胞(白細胞、紅細胞、血小板)及其他細胞抗原標志物的差異進行分選的一類方法。免疫磁珠分離法是目前最常用的CTCs富集方法之一，該方法利用特異性的單克隆抗體標記的磁珠結合腫瘤細胞表面特異性抗原來識別CTCs，其中以上皮源性惡性腫瘤均表達的上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)最常用，通過外加磁場作用吸附抗原-抗體復合物從而分離富集CTCs。由于原發(fā)性腫瘤細胞可發(fā)生上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等變化導致CTCs內(nèi)部存在異質性，部分CTCs轉變?yōu)殚g質表型不再表達EpCAM等上皮型標志物[12]，導致依賴上皮型標記物的免疫學富集方法CTCs采收率偏低[13，14]。

微流控芯片是一類檢測過程可實現(xiàn)自動化的高分子微流控裝置，采樣、稀釋、添加試劑、反應、分離等流程被集成到一塊芯片上，可控流體在芯片中流動時CTCs 的生物標志物被芯片識別從而捕獲樣本中的CTCs。目前，最常用的生物標志物為EpCAM，主要有CTC-chip、CTC-HBchip、CTC-ichip和CMx等平臺，這些微流控芯片優(yōu)點在于富集流程高度自動化，且能使富集的CTCs保持較高的活性[15]，但仍然無法完全避免EpCAM下調導致的采收率偏低。Chikaishi等[16]報道一種非EpCAM依賴性檢測的光固化樹脂微流控平臺，該芯片平臺增加平足蛋白抗體這一非上皮型腫瘤標記物抗體，在同一樣本條件下采收率相對于傳統(tǒng)的EpCAM依賴性平臺采收率增加78.3%。

1.2 CTCs的鑒定

1.2.1 免疫細胞化學法(immunocytochemistry，ICC)

ICC是利用抗原抗體特異性結合反應使熒光素、同位素、酶等顯色劑顯色來確定腫瘤細胞特異性抗原從而鑒定CTCs的方法，是目前使用最廣泛的CTCs測定方法。CellSearch系統(tǒng)的細胞鑒定部分即為該原理[17]。CellSearch系統(tǒng)是唯一通過美國FDA批準多用于臨床乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌的CTCs檢測系統(tǒng)，在胰腺癌CTCs中應用也取得一定進展。CTCs經(jīng)免疫細胞化學染色法鑒定主要表現(xiàn)為上皮型標志物抗體如EpCAM、上皮型鈣黏蛋白(E-Cadherin)、細胞角蛋白8/18/19(cytokeratin 8/18/19，CK8/18/19)抗體等[18～22]標記為陽性，血細胞特異性標志物如CD45等抗體標記陰性。由于EMT的存在導致部分CTCs轉變?yōu)榉巧掀け硇停挂蕾嚿掀ば蜆酥疚锏腎CC技術鑒定存在誤差[23]。近年來，一些非上皮型標志物如波形蛋白(Vimentin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-Cadherin)、鋅指結構E-box結合蛋白1(Zinc finger E-box binding homebox 1，ZEB1)等的應用提高了CTCs的檢出率[12，24，25]。但目前TCC尚無統(tǒng)一的 CTCs 標記物鑒定方案及標準，使用不同標記物方案的ICC方法的研究鑒定結果存在較大差異。

上皮細胞免疫斑點法(epithelial immunospot，EPISPOT)使用涂有特定標記物抗體斑點的硝化纖維素膜與待測樣本中腫瘤細胞分泌蛋白結合產(chǎn)生抗原-抗體反應，再采用攝像機成像和計算機輔助分析技術對免疫反應斑點進行分析以鑒定CTCs的技術，該技術是目前唯一能在單細胞水平上測定有活性細胞的CTCs的鑒定方法，已用于結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤類型[26]。Budna等[14]利用 EPISPOT、CellCollector、CellSearch 3種檢測方法測定前列腺癌CTCs，結果顯示相同樣本EPISPOT的檢出率(54%)高于CellCollector(52%)和CellSearch(13%)，EPISPOT 技術相對于EpCAM依賴性測定方法有更高的臨床應用價值。但因死細胞、無活性細胞不能分泌足夠的蛋白質以進行檢測，該法僅能測定有分泌功能的活性CTCs，且目前缺少胰腺癌CTCs特異性分泌蛋白標志物，該技術胰腺癌相關的應用及研究較少。

1.2.2 熒光原位雜交術(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH) FISH通過將熒光核酸探針以堿基互補配對的方式，與待測樣本中的特定細胞核酸序列配對雜交測定CTCs，具有實驗周期短、特異性好、定位準確等優(yōu)點[27]，常應用于CTCs相關染色體易位片段的研究。FISH與免疫學測定方法聯(lián)合使用可以提高CTCs檢出率，是目前應用于CTCs檢測的主要形式。Xu等[28]用8號染色體陰性富集聯(lián)合FISH NE-iFISH系統(tǒng)檢測40例PDAC外周血CTCs,陽性率為90% (36/40)，ROC曲線顯示當截斷值為1.5 CTCs7.5 ml時，對CTCs的檢測靈敏度為77.5%，特異性為79.1%，同一標本條件下鏡檢NE-iFISH系統(tǒng)測得CTCs亞型多樣性明顯強于CellSearch系統(tǒng)。Ko等[29]報道1種免疫磁珠與RNA熒光原位雜交技術(Turbo RNA FISH)相結合的新型CTCs檢測平臺，由于具備FISH的高特異性和磁微孔對CTCs的高敏感性，有早期診斷胰腺癌的潛力，但聯(lián)合檢測方案操作步驟相對復雜，容易造成信號丟失出現(xiàn)假陰性，對設備和試劑水平要求較高，一定程度上限制其推廣應用。

1.2.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) RT-PCR通過PCR技術擴增并識別腫瘤特異性mRNA序列的逆轉錄DNA片段從而對CTCs進行測定。目前，胰腺癌CTCs常用的mRNA序列有CK20 mRNA、CEA mRNA、EpCAM mRNA等[30]。由于技術手段成熟且特異性高，RT-PCR已成為目前最主流的CTCs測定方法之一，廣泛應用于多種類型腫瘤CTCs 的檢測及其預后研究[31]。RT-PCR同時也是胰腺癌 CTCs 分子生物學標志物研究及生物治療靶點研究的重要方法。Xu等[32]采用RT-PCR檢測并發(fā)現(xiàn)胰腺癌CTCs中受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1)mRNA表達水平升高，ROR1有成為胰腺癌治療靶點的潛在價值。

1.2.4 流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM) FCM是一項以細胞熒光化學及單克隆抗體技術為基礎，能夠對單細胞或其他生物粒子進行定量高速分析和分選的測定手段，能同時從一個細胞中測得細胞內(nèi)DNA含量、細胞活力及細胞特異性標志物等多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準確性好等顯著優(yōu)點。Guglielmi等[33]采用ClearCell FX1系統(tǒng)(基于腫瘤細胞標記物 EpCAM、CD45等)標記胰腺癌患者 CTCs并使用流式細胞儀分離CTCs，獲得較高的檢出率(60%)的同時保持CTCs的完整性。主要缺點在于靈敏度還不夠高，存在細菌污染、細胞凝集等問題[34]。近年來，以FCM為基礎的許多新型技術如活體無標記光聲流式圖像細胞儀(photoacoustic flow cytometry, PAFC)、單細胞網(wǎng)絡譜分析細胞儀、聲波聚焦細胞儀等提高CTCs測定效率和靈敏度，具有無創(chuàng)檢測、異質性亞群分析等優(yōu)勢[34～37]。

2 CTCs檢測在胰腺癌預后評估中的應用

2.1 CTCs與胰腺癌預后

胰腺癌常用的標志物CA19-9、CA242等靈敏度、特異度較差，仍缺少高特異性的預后評估標志物[38]。CTCs是惡性腫瘤轉移前亞群具有作為潛在預后評估標記物的價值[14]。Yang等[39]采用免疫熒光細胞化學方法檢測胰腺癌患者外周血CTCs，外周血<3 CTCs7.5 ml組總體生存期顯著長于≥3 CTCs7.5 ml組(15.2月 vs. 10.2月,P=0.023)，多因素分析顯示單位外周血高 CTCs計數(shù)是胰腺癌預后較差的獨立危險因素(HR=4.547，95%CI: 1.323～15.625，P=0.016)。

由于EMT等分子生物學改變的發(fā)生，CTCs群體內(nèi)部存在異質性，不同表型CTCs的預后評估價值也存在一定差異。Katherine等[40]通過免疫熒光法用細胞角蛋白、波形蛋白抗體鑒定50例胰腺癌外周血CTCs，結果顯示39例(78%)CTCs為單純上皮表型，表達細胞角蛋白而不表達波形蛋白，26例(67%)CTCs表達細胞角蛋白的同時也表達間質標志物波形蛋白，外周血中只表達上皮表型標志物的CTCs檢出是胰腺癌患者總生存期短的獨立危險因素(P<0.01)，表達上皮和間質表型的CTCs檢出是腫瘤復發(fā)的預測因子(HR=2.78, 95%CI：1.31～5.88,P=0.01)。

利用CTCs與胰腺癌預后的相關性，對CTCs進行動態(tài)檢測可用以評估輔助治療的療效，指導治療方案的調整及選擇[41，42]。Anemura等[43]采用ICC檢測16例胰腺癌新輔助放化療(吉西他濱、愛斯萬S-1聯(lián)合全劑量放療)前、新輔助放化療治療1個月后、手術切除后外周靜脈血CTCs，結果顯示截止新輔助放化療前，4例CTCs陽性者術后肝轉移率高于11例CTCs陰性者(50% vs. 0%)，此4例化療后CTCs持續(xù)升高，2例在R0切除后早期發(fā)生肝轉移并死亡，建議CTCs陽性患者選擇先手術再行化療的策略。

2.2 門靜脈CTCs的檢測及其預后評估價值

門靜脈CTCs的預后研究相對外周血較少，由于未經(jīng)肝臟濾過相對于外周血在CTCs檢出率上更具優(yōu)勢[44]，為CTCs的亞群研究、免疫抑制機制研究提供更多細胞來源[45]，目前尚無研究顯示門靜脈CTCs群落和外周血CTCs群落在分子表型上存在明顯差異。目前，門靜脈CTCs標本常見的獲取方式有術中暴露門靜脈及其分支，抽取門靜脈循環(huán)血液標本[46]以及通過超聲引導下肝穿刺從門靜脈系統(tǒng)中獲取標本[47]2種方式。獲取標本后CTCs的富集及鑒定技術基本同外周血CTCs。

門靜脈CTCs作為胰腺癌預后評估指標的價值在多個研究中得到證實。Liu等[47]超聲引導下經(jīng)肝穿刺對晚期胰腺癌門靜脈血液中的CTCs進行分析，29例門靜脈標本均檢測到CTCs，轉移患者門靜脈CTCs平均為449.0/7.5 ml，明顯高于16例局部進展期161.0/7.5 ml(P=0.0054),門靜脈CTCs高計數(shù)與腫瘤轉移存在相關性；11例門靜脈CTCs低于150/7.5 ml，中位總生存期19.8周(95%CI: 16.8～25.4)，顯著長于17例門靜脈CTCs高于150/7.5 ml的中位總生存期9.2周(95%CI：7.8～11.8)，門靜脈CTCs>150/7.5 ml預示患者OS顯著縮短(log-rank檢驗，P<0.0001)。

除此之外，門靜脈CTCs作為預后評估標志物價值與外周血CTCs存在的差異在多個研究中報道，門靜脈血中CTCs的高表達與胰腺癌術后早期發(fā)生肝轉移存在顯著的相關性[48，49]。Tien等[50]檢測41例PDAC體循環(huán)和術中門靜脈CTCs，術后每3個月復查肝臟MR，多因素分析顯示門靜脈CTCs的數(shù)量是術后6個月內(nèi)肝轉移的唯一獨立影響因子(OR=1.0122, 95%CI：1.0053～1.0226,P=0.0042)，術后早期肝轉移患者門靜脈CTCs計數(shù)顯著大于無早期肝轉移患者(402.94±838.77 vs 29.72±43.56，P<0.001),早期肝轉移與無早期肝轉移患者外周靜脈CTCs計數(shù)無統(tǒng)計學差異(61.18±112.48 vs.19.19±29.69,P=0.296)。

2.3 CTCs與胰腺癌預后相關性的分子生物學證據(jù)

隨著各種新型分子生物學層面檢測工具的應用，CTCs的檢測流程已不再局限于CTCs的富集和鑒定計數(shù)，還可以對CTCs特異性腫瘤標志物進行分子生物學參數(shù)測定，CTCs的具體測定工具及方法本文不再展開敘述。EMT等分子生物學改變被證實可提高腫瘤細胞的存活率和侵襲性[14]，多個CTCs相關的腫瘤信號轉導通路及組件在促進腫瘤增殖、進展的作用被發(fā)現(xiàn)，為CTCs表達與患者預后的相關性不斷提供新的分子生物學證據(jù)。楊靜等[51]對48例胰腺癌CTCs的研究結果顯示，胰腺癌術后復發(fā)者TLR4、TLR9、myd88表達水平明顯高于未復發(fā)者(TLR4：3.16±1.02 vs.2.34±0.46；TLR9:3.34±1.09 vs. 2.68±0.65；myd88：2.76±0.67 vs.2.12±0.55；P<0.05)，CTCs中TLRs/myd88信號表達水平與轉移、復發(fā)密切相關。近年來的研究顯示，TGFBI基因、KRAS突變基因、PD-L1、MUC-1、BIRC5等多個CTCs相關信號傳導組件的異常表達在胰腺癌及其他惡性腫瘤細胞增殖、遷移和信號轉導過程中的潛在促進作用[52～55]。

CTCs 在炎癥微環(huán)境中與中性粒細胞、淋巴細胞、調節(jié)性T細胞(Treg細胞)、PD-1(+)、CD8(+)T細胞等免疫細胞的相互作用可促進CTCs發(fā)生免疫逃逸[56～58]。Tao等[47]采用免疫熒光法檢測160例胰腺癌癌旁血管采集的血樣中CTCs，免疫熒光結果顯示PDAC患者腫瘤鄰近血管中CTCs被白細胞群落包圍，中性粒細胞/淋巴細胞比例與術后遠處轉移有顯著相關性(HR=2.15, 95%CI：1.279～3.615,P=0.004)，提示血液中CTCs與中性粒細胞可能通過某種相互作用而協(xié)助其遠處轉移。

盡管目前大部分同類研究中CTCs與胰腺癌預后的相關性得到肯定，但仍有部分研究得出陰性結果。Sergeant等[59]應用RT-PCR檢測40例PDAC胰腺切除術外周血和腹腔積液EpCAM陽性腫瘤細胞，血液和腹腔積液EpCAM陽性腫瘤細胞的檢出與胰腺癌生存期無相關性(血液：log-rank檢驗，P=0.17；腹腔積液：log-rank檢驗，P=0.28) ，CTCs的預后評估價值目前仍存在一定的爭議。

3 結語

CTCs在循環(huán)中含量較少,內(nèi)部異質性較大，對富集檢測技術要求較高。近年來，檢測技術不斷進步，許多新型的檢測手段具有檢測過程高度自動化，可避免因CTCs表面標志物下調所致的檢出率降低，能夠獲取大量有活性的CTCs，對CTC進行多參數(shù)的分析等優(yōu)點。CTCs 與胰腺癌預后的相關性目前已在多個研究中得到初步驗證，分子生物學機制的研究進展也印證了CTCs作為預后評估標志物的潛在價值。對CTCs的預后評估價值的研究應開展更多大樣本、多中心、多參數(shù)、前瞻性的研究，制定標準化CTCs檢測方案及鑒定標準，進一步推動其在臨床實踐中的應用。