李 杰 牟宗娟, 楊慧超,3 茅云翔 閻永偉 莫照蘭,3

條斑紫菜()綠斑病病原菌的分離鑒定*

李 杰1牟宗娟1,2楊慧超1,3茅云翔2閻永偉1莫照蘭1,3①

(1. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室農業(yè)農村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；2. 中國海洋大學海洋生命學院 青島 266003; 3. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306)

綠斑病(Green spot disease)是一種常見的海區(qū)栽培條斑紫菜()病害，在整個紫菜栽培期間都可能發(fā)生，以每年11~12月份最為嚴重，主要出現(xiàn)在幼葉期和成葉期。首先，在葉狀體上出現(xiàn)紅色或淡紅色小斑，而后逐漸轉變?yōu)榫G色，病斑繼續(xù)擴展，在葉狀體表面形成若干孔洞，后期幾乎整個藻體變綠。本研究對日照地區(qū)患綠斑病的條斑紫菜進行病原菌分離純化，得到5株優(yōu)勢菌(編號為Y1~Y5)，人工回感實驗結果顯示，Y1可以引起健康條斑紫菜發(fā)生綠斑病。對Y1進行了生理生化檢測、16S rRNA、和基因序列分析，確定病原菌為海洋假交替單胞菌()。對綠斑病的發(fā)病進程進行了觀察，并檢測了培養(yǎng)溫度、海水比重和養(yǎng)殖密度等環(huán)境因子對綠斑病發(fā)生的影響，結果顯示，高溫和高密度養(yǎng)殖會加速綠斑病病情的發(fā)展，海水比重為1.022時，綠斑病發(fā)病較嚴重。本研究確定了一株引起條斑紫菜綠斑病的病原菌，并分析了部分理化因子對感染的影響，為條斑紫菜綠斑病的防控提供了基礎數(shù)據(jù)。

條斑紫菜；葉狀體；綠斑?。缓Ｑ蠹俳惶鎲伟?/p>

條斑紫菜()是大型潮間帶藻類，自然分布較廣，自遼寧至浙江，適合紫菜生長的巖礁海域均可發(fā)現(xiàn)其蹤跡(曾呈奎等, 1985)。條斑紫菜的栽培主要集中在中國、日本和韓國，其味鮮美，含有豐富的必需氨基酸、維生素和礦物質，是中國兩大紫菜栽培品種之一。

隨著條斑紫菜栽培規(guī)模的擴大，密集栽培技術的發(fā)展，其病害問題表現(xiàn)越來越突出，嚴重影響紫菜的產量和商品質量。據(jù)不完全統(tǒng)計，條斑紫菜育苗和栽培過程中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)病害16種，已報道和發(fā)現(xiàn)的包括綠斑病、赤腐病、擬油壺菌病、絲狀細菌癥、癌腫病、縮曲癥、黃斑病和色圈病等多種紫菜病害(Nakao, 1972; Fujita, 1973; Lin, 1984; 陳秋萍等, 1991; 馬家海, 1992、1996; 馬家海等, 1999; 閆詠等, 2002)。紫菜的病害是由多方面原因引起的，致病機理非常復雜，微生物是不可忽視的重要因素之一。本研究針對山東省日照地區(qū)條斑紫菜葉狀體綠斑病，開展了病原分離鑒定、致病性檢測、發(fā)病進程及環(huán)境因子影響等一系列研究，旨在探明綠斑病的病因和病理，并為該病的防治提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用條斑紫菜

患綠斑病條斑紫菜于2010年11月采自山東省日照嵐山海區(qū)條斑紫菜養(yǎng)殖場，水溫為18℃；健康條斑紫菜采自山東省青島匯泉灣以及團島，養(yǎng)殖于PES海藻培養(yǎng)基中(馬家海, 1996)。

1.2 細菌分離

選擇癥狀明顯的條斑紫菜葉狀體，無菌海水漂洗數(shù)次，剪取病斑藻段、勻漿，用無菌海水梯度稀釋勻漿液，涂布2216E海水培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)5 d，挑取菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢菌，采用15%的甘油保種、保存于–80℃冰箱備用。

1.3 人工感染

挑選顏色正常的健康條斑紫菜葉狀體，除去藻體表面雜質，置于0.7% KI溶液中浸泡15 min(方文雅, 2010)，用滅菌海水沖洗后用于回感實驗。

將分離得到的疑似病原菌在2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，用滅菌PES-海水沖洗3次后重懸。吸取一定量菌懸液加到滅菌PES-海水中，制備細菌終濃度為108和107CFU/ml的PES-海水，以滅菌PES-海水作為陰性對照。每個濃度感染5片紫菜葉狀體，培養(yǎng)溫度為15℃，光照周期L︰D=12︰12 (h)，光強為62.5 μmol/m2·s (5000 lx)。每個感染組和對照組設置3個平行，觀察紫菜葉狀體的病理發(fā)展過程，實驗結束時，選擇具有病癥的紫菜進行細菌分離鑒定，以確證病原菌。

1.4 病原菌鑒定

采用革蘭氏染色法對細菌進行染色，鏡檢；采用Vitek 2-GN和API-ID32E生理生化檢測試劑盒(生物梅里埃公司, 法國)，參照產品使用說明書對病原菌進行生理生化特征測定；利用16S rRNA基因引物27F (5￠-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3￠)和1492R (5￠- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3￠)，PCR擴增Y1 16S rRNA基因序列；根據(jù)NCBI中20余種假交替單胞菌()的和基因序列，通過BioEdit軟件對比序列分析，選擇保守區(qū)設計2對簡并引物F (5￠-GTGTATYTGTCGGTTTGGC-3￠)、R(5￠-TNARYTCTTTWGAYARHGCC-3￠)和F (5￠-CCDYTRRTRCARGTDTCDGGYGC-3￠)、R (5￠-AYARDCGCATHGGCATSACNAC-3￠)，PCR擴增Y1和基因片段，片段長度分別為1301和1124 bp，PCR反應條件：95℃預變性5 min， 95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min。將擴增得到的PCR產物送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序，獲得的序列信息在GenBank中用Blast(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/)進行同源性比較，利用MEGA 5.0軟件，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap=1000)。

1.5 環(huán)境因子對感染的影響

培養(yǎng)溫度分別設置為8℃、15℃、18℃和22℃，檢測溫度對綠斑病發(fā)病的影響；條斑紫菜密度分別設置為 0.05 g/100 ml、0.1 g/100 ml和0.2 g/100 ml，檢測紫菜養(yǎng)殖密度對綠斑病發(fā)病的影響；用無菌超純水調節(jié)海水比重為1.019、1.022和1.025(相對應的海水鹽度分別為24.5、29.1和32.7)，檢測海水比重對綠斑病發(fā)病的影響。每個實驗組設置3個平行，除變化的環(huán)境因子，其他培養(yǎng)條件：溫度為18℃、密度為0.1 g/100 ml，海水比重為1.022。實驗組分別加入終濃度為108CFU/ml的病原菌，對照組在同樣條件下不加入病原菌培養(yǎng)。觀察葉片的變化，并計算感染 1周后病爛部分面積所占整個葉片面積的百分比和培養(yǎng)體系中細菌數(shù)量的變化。

2 結果與分析

2.1 綠斑病及細菌分離

條斑紫菜綠斑病發(fā)病部位多位于葉狀體的中部和邊緣，初期發(fā)病紫菜葉片出現(xiàn)紅色小點，擴大后逐漸轉變成灰綠色，在葉狀體表面形成若干孔洞，葉片腐爛變綠(圖1A)。在2216E培養(yǎng)基上共分離得到5株優(yōu)勢菌，分別編號為Y1、Y2、Y3、Y4和Y5。

2.2 人工感染

菌株Y1感染紫菜可以產生明顯綠斑病癥狀 (圖1B)，Y2、Y3、Y4和Y5各個濃度梯度感染的條斑紫菜均未觀察到發(fā)病。Y1菌株108CFU/ml感染組紫菜在培養(yǎng)2 d后出現(xiàn)病癥，107CFU/ml感染組在10 d出現(xiàn)病癥。顯微鏡觀察可見，在病斑形成位置，最初單個紫菜細胞發(fā)生明顯變化，原生質濃縮，顏色由正常的紫褐色變?yōu)樽霞t色，細胞形狀變成不規(guī)則狀(圖2A)，進一步周圍的細胞漸漸失去細胞正常結構(圖2B)，后期以這些病變細胞為中心，呈放射狀蔓延(圖2C)，邊緣的細胞顏色漸漸變綠并最終形成肉眼可見的病斑(圖2D)。條斑紫菜葉狀體病變部分與健康部分區(qū)別明顯，且病變部分細胞由于顏色不同可以清晰地分為多個不同狀態(tài)的細胞層(圖2E、圖2F)。

圖1 海區(qū)自然發(fā)病條斑紫菜(A)和人工感染發(fā)病條斑紫菜(B)

2.3 病原菌的鑒定

革蘭氏染色結果顯示，Y1屬于革蘭氏陰性短桿菌。Vitek 2 GN鑒定結果顯示，其丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶(APPA)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、脂酶(LIP)、酪氨酸芳胺酶(TyrA)、α-半乳糖苷酶(α-GAL)、磷酸酶(PHOS)以及ELLM反應為陽性，其他均為陰性。經ID-32E鑒定，α-葡萄糖(α-GLU)、α-麥芽糖苷酶(α-MAL)和L-天門冬素芳胺酶(ASPA)反應為陽性，其他反應為陰性。ATB系統(tǒng)分析結果顯示，Y1為假交替單胞菌()。

對Y1的16S rRNA、和基因進行擴增測序和GenBank比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果顯示，Y1的基因序列與海洋假交替單胞菌()相似度均為99%~100%，且系統(tǒng)進化樹與海洋假交替單胞菌聚為一支(圖3)，表明Y1與海洋假交替單胞菌進化關系最為相近，確定引起此次條斑紫菜綠斑病的病原為海洋假交替單胞菌。

圖2 人工感染條斑紫菜

A：單個紫菜細胞濃縮變色；B：多個紫菜細胞濃縮變色；C：初期形成的綠斑；D：葉片破碎形成孔洞；E和F：綠斑和正常細胞交界處細胞質顆粒降解的細胞層

A: Concentration and discoloration ofsingle cell; B: Concentration and discoloration ofcells; C: Early stage of green spot disease; D: Holes on laver; E and F: Cytoplasmic granules degradation at the junction of diseased and normal cells

圖3 Y1系統(tǒng)進化發(fā)育分析

A: 基于16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹; B: 基于序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹; C: 基于序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

A: Phylogenetic tree constructed for isolates based on 16S rRNA gene sequences; B: Phylogenetic tree constructed for isolates based onsequences; C: Phylogenetic tree constructed for isolates based onsequences

2.4 環(huán)境因子對感染的影響

設置4個不同的感染溫度，檢測了溫度對條斑紫菜綠斑病發(fā)病的影響。結果顯示，在感染溫度為18℃時，條斑紫菜發(fā)病最快，感染36 h后，可觀察到紅色斑點；感染溫度為15℃和22℃時，感染48 h后出現(xiàn)癥狀；感染溫度為8℃時發(fā)病較慢，感染72 h后出現(xiàn)1~2個很小的斑點。除22℃高溫組，各組的對照組在整個實驗過程中未觀察到明顯病爛癥狀。感染培養(yǎng)7 d后，除8℃組僅有幾個斑點外，其余各實驗組葉狀體均可見多個病爛區(qū)，并伴有組織脫落。各實驗組葉狀體病爛部分面積所占總面積的比例如圖4A所示，當感染溫度為22℃時，葉狀體病爛最嚴重，幾乎看不到正常的葉片部分。

設置3個不同的養(yǎng)殖密度，檢測了密度對條斑紫菜綠斑病發(fā)病的影響。低密度條件下病爛部分最少，隨著養(yǎng)殖密度的增大，病爛程度有所加劇。感染72 h后，0.2 g/100 ml組出現(xiàn)多個明顯的病斑，0.1 g/100 ml組僅出現(xiàn)1~2個病斑，0.05 g/100 ml組沒有出現(xiàn)病斑。感染7 d后，各組都出現(xiàn)嚴重病爛。經計算，各實驗組葉狀體病爛部分面積所占總面積的比例如圖4B所示，0.05 g/100 ml實驗組病爛面積最小，約45%的葉片出現(xiàn)病爛；0.1 g/100 ml組與0.2 g/100 ml組病爛面積較大，超過60%的葉片出現(xiàn)病爛。

設置3個不同比重的海水，檢測海水比重對條斑紫菜綠斑病發(fā)病的影響。正常海水比重組葉狀體(1.022)在感染2 d后出現(xiàn)紅色斑點，7 d后明顯病爛；低海水比重組(1.019)和高海水比重組(1.025)分別在感染4 d和5 d之后，出現(xiàn)紅色斑點，且發(fā)生病爛的面積較小。7 d后，各實驗組葉狀體病爛部分面積所占總面積的比例如圖4C所示，1.019低海水比重組和1.025高海水比重組海水都能一定程度上延緩病情的發(fā)生進展。

圖4 環(huán)境因子對條斑紫菜綠斑病發(fā)病的影響

3 討論

綠斑病是紫菜栽培過程中的常見疾病，在整個紫菜栽培期都可能發(fā)生，但以每年11、12月份最為嚴重(丁懷宇, 2008)。綠斑病多發(fā)生于栽培密度較大的海區(qū)，尤其是在高溫后極易發(fā)生，病變的部位不定，在條斑紫菜葉狀體的梢部、中部、基部、中央和邊緣部位均可出現(xiàn)病斑。綠斑病一旦發(fā)生，傳染的速度極快，病斑可在短時間內連成一片，并迅速變綠，在適宜條件下，藻體1周即可全部潰爛，嚴重時，網簾上紫菜完全脫落。綠斑病會使紫菜表面粗糙、無光澤，影響其商品價值。2013~2014年，韓國舒川郡紫菜養(yǎng)殖場綠斑病爆發(fā)造成110萬美元的損失，相當于總銷售額的10.7%(Kim, 2014)。

1968年綠斑病在日本首次發(fā)現(xiàn)，其病原較為廣泛，從患病紫菜中可以分離出微球菌(sp.)、假單胞菌(sp.)以及弧菌(sp.)(Nakao, 1972)，中國已報道檸檬假交替單胞菌()引起的條斑紫菜綠斑病(閆詠等, 2002)，本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)弧菌也可以引起壇紫菜()綠斑病(韓曉娟等, 2015)。目前報道的綠斑病病原菌大部分具有較強的胞外酶活性，這些胞外酶導致的宿主損傷可能是引起紫菜葉片綠斑的重要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體病毒(Chloroplast virus)也可以引起條斑紫菜綠斑病的發(fā)生(Kim, 2016)。

綠斑病只是一種表觀特征，多種因素造成的藻體破壞、藻紅素溶出，均可呈現(xiàn)綠斑病癥狀。海水溫度異常升高、降雨或有機質污染引起藻體代謝失常都可能引起紫菜綠斑病(Gachon, 2010)，但環(huán)境脅迫條件下導致的附生微生物菌群失控是引起紫菜病爛的主要因素(Egan, 2016)。通過環(huán)境因子實驗結果，發(fā)現(xiàn)高溫、高密度養(yǎng)殖是引起紫菜綠斑病發(fā)生的主要因子，而海水比重的變化在一定程度上可以減緩病爛速度，這也與海區(qū)栽培情況相印證。每年11、12月份，海區(qū)紫菜進入快速生長期，此時網簾上紫菜密度較大，為致病菌提供了豐富的營養(yǎng)和良好的環(huán)境。在正常養(yǎng)殖條件下，條件致病菌數(shù)量一般維持在一定范圍內，不具備致病力。當出現(xiàn)升溫或降雨等環(huán)境變化，條件致病菌的致病性可能增強，造成紫菜綠斑病的發(fā)生。合理控制養(yǎng)殖密度，及時疏苗，密切注意水溫等氣象環(huán)境的變化，充足的干出以改變紫菜表面海水比重等方法可以有效抑制綠斑病的發(fā)生。

本研究通過人工回接感染實驗、細菌生理生化和基因序列分析，發(fā)現(xiàn)海洋假交替單胞菌可以引起條斑紫菜的綠斑病，養(yǎng)殖密度、溫度和海水比重等環(huán)境因子會影響綠斑病的發(fā)病進程，其具體感染和致病機制有待進一步深入研究。

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Isolation and Identification the Pathogen ofGreen Spot Disease

LI Jie1, MOU Zongjuan1,2, YANG Huichao1,3, MAO Yunxiang2, YAN Yongwei1, MO Zhaolan1,3①

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003; 3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Green spot disease is one of the major disease considerations in the farming of. Green spot disease could be found in all the periods of thallus, and outbreaksusually occur in November and December. At the start of infection, small light red spots could be found on the thallus, and then the spots gradually turned green and expanded quickly. Holes from lesions formed later in the surface of thallus. At last, the entire thallus became green and fell off. In this research, bacteria strains were isolated from.with green spot disease farmed in Rizhao. Experimental infection showed that the strain Y1 could cause.green spot disease. Biochemical characterization and genes analysis of 16S rRNA,andindicated that the pathogen Y1 was. Influence of environmental factors on the outbreak of disease were also characterized by experimental infection with different temperature, stocking density and gravity of sea water. The results showed that higher temperature and stocking density will accelerate the spread of the disease, but gravity of sea water within a certain range did not affect the occurrence of the disease. In this study, we described the green spot disease caused by., which provides information for disease control in.cultivation.

; Thallus; Green spot disease;

MO Zhaolan, E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

S946.2

A

2095-9869(2019)04-0140-07

10.19663/j.issn2095-9869.20180710002

* 現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系(CARS-50)、國家高技術研究發(fā)展計劃(2012AA10A406)、國家科技基礎條件平臺建設運行項目(2018DKA30470)和鰲山科技創(chuàng)新計劃(2015ASKJ02)共同資助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-50), National High-Tech R&D Program (2012AA10A406), National Science and Technology Infrastructure Platform Construction (2018DKA30470), and Aoshan Technology Innovation Program (2015ASKJ02)]

李 杰，E-mail: lijie@ysfri.ac.cn

莫照蘭，研究員，E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

2018-07-10,

2018-07-30

李杰, 牟宗娟, 楊慧超, 茅云翔, 閻永偉, 莫照蘭. 條斑紫菜()綠斑病病原菌的分離鑒定. 漁業(yè)科學進展, 2019, 40(4): 140–146

Li J, Mou ZJ, Yang HC, Mao YX, Yan YW, Mo ZL. Isolation and identification the pathogen ofgreen spot disease. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 140–146

(編輯 馬璀艷)