司 飛 王青林 于清海 劉洪波 姜 濤 楊 健 王 俊

基于投喂法的牙鲆耳石鍶標(biāo)記*

司 飛1王青林1于清海1劉洪波2姜 濤2楊 健2王 俊3①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站 秦皇島 066100；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 無錫 214081；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室(青島) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

本研究首次采用投喂標(biāo)記飼料的方法，對(duì)牙鲆()耳石鍶(Sr)標(biāo)記進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置1、8、64 g/kg (SrCl2?6H2O/飼料) 3個(gè)梯度，無SrCl2?6H2O添加飼料為對(duì)照組，投喂標(biāo)記飼料10 d，再養(yǎng)殖30 d后采樣。利用EPMA對(duì)樣本的矢耳石進(jìn)行線性定量和面分析，檢測(cè)耳石Sr標(biāo)記效果。結(jié)果顯示，8、64 g/kg實(shí)驗(yàn)組耳石均出現(xiàn)Sr標(biāo)記。8 g/kg組耳石Sr標(biāo)記峰值為對(duì)照組的2倍，64 g/kg組耳石Sr標(biāo)記峰值較對(duì)照組分別高6倍和18倍，Sr標(biāo)記峰值隨著標(biāo)記飼料濃度增加而增大。對(duì)各梯度組生長研究發(fā)現(xiàn)，1、8 g/kg梯度組全長分別為(11.11±1.32) cm和(10.88±1.07) cm，差異不顯著(>0.05)，1、8 g/kg梯度組與0、64 g/kg梯度組全長差異顯著(<0.05)，說明攝食適量Sr元素，可促進(jìn)魚體生長。標(biāo)記期間，各梯度組均未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)魚死亡，表明Sr元素對(duì)牙鲆安全無毒。本研究為海水魚類耳石元素指紋標(biāo)記探索了新的標(biāo)記途徑，為科學(xué)進(jìn)行牙鲆增殖放流效果評(píng)估積累了參考資料。

鍶標(biāo)記; 耳石; 牙鲆

牙鲆()是亞洲沿岸分布的唯一鲆科魚類，因其個(gè)體大、味道鮮美，是東亞各國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類。近年來，由于沿海污染嚴(yán)重，加之捕撈過度，牙鲆自然資源顯著減少(陳睿毅等, 2013; 童愛萍等, 2015)。我國在20世紀(jì)80年代開始進(jìn)行牙鲆增殖放流研究(吳鶴洲等, 1987)，但規(guī)模不大，以放流品種平均年放流量為指標(biāo)統(tǒng)計(jì)，2004年牙鲆僅占放流魚類總量的7%(劉莉莉, 2007)，累計(jì)放流約70萬尾(張秀梅等, 2009)。從2005年開始，隨著政府各部門投入的增加，牙鲆增殖放流數(shù)量增大(宋娜等, 2010)，目前，牙鲆已成為我國海水魚類增殖放流的主要品種之一。但是，單純一味追求放流數(shù)量的增長并不能一定起到很好的增殖效果，關(guān)鍵要進(jìn)行放流策略的研究以及放流效果的評(píng)估(劉琦, 2009)。

準(zhǔn)確有效地鑒別放流牙鲆是進(jìn)行放流效果評(píng)估的前提。目前，在牙鲆放流中常用的標(biāo)記手段包括生態(tài)標(biāo)記、體外標(biāo)記、體內(nèi)標(biāo)記和分子標(biāo)記(于廣寶等, 2016; 劉芝亮等, 2013; 徐永江等, 2017; Sekino, 2005; Liu, 2017)。其中，生態(tài)標(biāo)記、耳石熒光標(biāo)記存在消退問題(朱學(xué)武等, 2017)，體外標(biāo)記(掛牌法)適用于大規(guī)格苗種，目前，放流牙鲆的規(guī)格(體長5 cm左右)限制了體外標(biāo)記的使用。分子標(biāo)記需要明確所有參與繁殖親本的遺傳學(xué)信息(童愛萍, 2015)，目前，我國放流實(shí)施單位多、苗種來源不明等，現(xiàn)階段很難構(gòu)建參與繁殖親本群體的遺傳學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(羅剛等, 2016)。因此，急需開發(fā)一種適合大規(guī)模牙鲆的群體標(biāo)記方法。

耳石元素指紋標(biāo)記是魚類標(biāo)記放流研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)重要技術(shù)手段。耳石是魚類內(nèi)耳自然生物礦化沉積形成的碳酸鈣結(jié)構(gòu)，是魚類形成最早的硬組織，其微結(jié)構(gòu)可以用來判讀魚類的年齡等生物學(xué)信息，而沉積其中的元素信息則記錄了魚類過去生活過的環(huán)境信息(王玉堃, 2015)。水環(huán)境中的化學(xué)元素通過魚類鰓部等組織進(jìn)入血液，經(jīng)過血液傳輸?shù)纫幌盗猩磉^程沉積在耳石生長輪上(竇碩增等, 2011)，形成不同的生境元素沉積特征，即元素指紋(Elemental fingerprints)。鍶(Sr)元素常被用于反演洄游性魚類的海、淡水生境履歷，進(jìn)而了解并重建其資源的時(shí)空動(dòng)態(tài)、產(chǎn)卵場(chǎng)位置、群體關(guān)聯(lián)性等重要的漁業(yè)信息。因此，人為提高水體中Sr濃度，達(dá)到異常增加耳石中局部Sr含量、形成特殊的Sr元素指紋標(biāo)記的目的。該標(biāo)記技術(shù)在溯河性魚類中研究較為廣泛(Skalski, 2009; Schroder, 1995)，在淡水魚類中的應(yīng)用也有報(bào)道(李秀啟等, 2017)，但在海水魚標(biāo)記放流中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。此外，以往的報(bào)道多為在養(yǎng)殖水體中直接添加Sr化合物進(jìn)行標(biāo)記，但缺乏通過餌料食源進(jìn)行Sr標(biāo)記的研究。因此，本研究擬探討通過餌料的應(yīng)用進(jìn)行牙鲆耳石Sr元素指紋標(biāo)記的可行性，并獲取最適暴露濃度等重要參數(shù)，以期為科學(xué)進(jìn)行牙鲆增殖放流效果評(píng)估、優(yōu)化牙鲆增殖放流策略提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)，也為海水魚類耳石微化學(xué)標(biāo)記工作提供重要的基礎(chǔ)信息和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)于2016年6月24日在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站開始進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)魚為80日齡、全長(6.58±0.59) cm的牙鲆幼魚。實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖在300 L玻璃鋼圓形水槽內(nèi)，每天08:00和14:00各投喂1次含氯化鍶的配合飼料。實(shí)驗(yàn)設(shè)0、1、8、64 g/kg 4個(gè)Sr標(biāo)記飼料梯度(SrCl2?6H2O g/顆粒飼料kg)，持續(xù)標(biāo)記10 d。各梯度組實(shí)驗(yàn)魚規(guī)格一致，數(shù)量均為400尾。標(biāo)記期間，各梯度投喂量為魚體總重的2%，實(shí)驗(yàn)魚攝食完畢后立刻吸底，保證各梯度均無殘餌。上午投喂結(jié)束后，換水清槽，然后加過濾海水并保持24 h流水，換水量為5個(gè)循環(huán)。標(biāo)記期間記錄各梯度實(shí)驗(yàn)魚死亡率，標(biāo)記后30 d測(cè)量記錄實(shí)驗(yàn)魚生長性狀并采集樣本，-20℃保存。各梯度組均選取2個(gè)樣本進(jìn)行耳石微化學(xué)分析(表1)。

表1 牙鲆耳石微化學(xué)分析樣品信息

Tab.1 Sampling details of Japanese flounder for otolith microchemical analysis

1.2 耳石采集及前處理

由于測(cè)試成本較高，各梯度組分別選取大小相對(duì)一致的2尾實(shí)驗(yàn)魚采集耳石。利用剪刀、尖頭鑷等工具將矢耳石取出后，用清水、酒精清洗，38℃烘干。將烘干耳石樣本用AB膠固定在包埋盒底座上，室溫靜置20 min，用環(huán)氧樹脂(Epofix，丹麥Struers公司；rensin與hardener質(zhì)量比7∶1)包埋，38℃烘干12 h以上。用AB膠將包埋塊固定在載玻片上，經(jīng)2 h凝固后使用裝配有金剛石磨輪的碾磨機(jī)(Discoplan-TS型，丹麥Struers公司)切割碾磨。切割后標(biāo)本經(jīng)初磨(500目砂輪)、精磨(1200目砂紙)打磨至耳石核心暴露，用磨拋機(jī)(LabPol-35，丹麥Struers公司)裝備織布機(jī)拋光盤配合拋光液拋光，至耳石表面無明顯劃痕。樣品放入超純水中超聲清洗5 min后，自然條件下晾干24 h，完全干燥后，使用真空鍍膜機(jī)(JEE-420，日本電子株式會(huì)社)蒸鍍碳膜(36 A，25 s)。為增加可比性，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用左矢耳石進(jìn)行元素指紋分析。

1.3 耳石元素指紋分析

使用日本電子株式會(huì)社的JXA-8100型電子探針微區(qū)分析儀(EPMA)進(jìn)行耳石Sr和Ca的微化學(xué)分析。自耳石核心沿最長徑至耳石邊緣的一條直線進(jìn)行定量線分析(Line transect analysis)。由于耳石中Sr離子含量遠(yuǎn)小于Ca離子含量，按照國際慣例將Sr/Ca離子含量比值標(biāo)準(zhǔn)化，即統(tǒng)一用Sr離子含量與Ca離子含量×103的比值表示。EPMA的參數(shù)設(shè)定：加速電壓為15 kV，電子束電流為2.0×10–8A；束斑直徑為2 μm，每點(diǎn)駐留時(shí)間15 s；以間距4 μm連續(xù)進(jìn)行打點(diǎn)測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)樣品使用碳酸鈣(CaCO3)和鈦酸鍶(SrTiO3)。所有耳石線分析完后再進(jìn)行面分析(Mapping analysis)。這時(shí)，EPMA加速電壓和電子束電流分別為15 kV，5.0×10–7A，束斑直徑為2 μm，每點(diǎn)駐留時(shí)間為30 ms，像素為4×4 μm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對(duì)定量線分析檢測(cè)的Sr、Ca含量及Sr/Ca比值、測(cè)定點(diǎn)、耳石徑等數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及處理，并對(duì)Sr/Ca比值作圖。使用SPSS 19.0軟件對(duì)各梯度組的不同階段Sr/Ca比值及生長數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan多重比較，檢驗(yàn)各梯度組的不同階段與對(duì)照組Sr/Ca比值及生長差異性，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各梯度組牙鲆耳石定量線分析的Sr/Ca比值

圖1為恢復(fù)養(yǎng)殖30 d牙鲆耳石定量線分析結(jié)果。對(duì)照組和1 g/kg梯度組均保持相對(duì)穩(wěn)定的Sr/Ca值(>0.05)，未出現(xiàn)Sr/Ca比值高峰，說明1 g/kg梯度組未形成明顯的Sr元素指紋標(biāo)記。8 g/kg和64 g/kg梯度組分別形成1~2個(gè)Sr/Ca比值波峰，Sr峰區(qū)Sr/Ca比值較對(duì)照組差異顯著(<0.05)，說明8 g/kg和64 g/kg梯度組均形成了明顯的Sr元素指紋標(biāo)記。進(jìn)一步分析得知，8 g/kg梯度組的BDHFE-5在距離耳石核心的780 μm處開始Sr/Ca比值明顯增大，904 μm處之后Sr/Ca比值趨于平穩(wěn)，即BDHFE-5在距離耳石核心的780~904 μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高峰值為10.18；BDHFE-6在距離耳石核心的780~956 μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高峰值為10.73；64 g/kg梯度組的BDHFE-7在距離耳石核心的640~724 μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高峰值為62.60；BDHFE-8在距離耳石核心的560~684 μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高峰值為143.64。8 g/kg梯度組Sr峰值為正常均值倍數(shù)為2.14~2.22，64 g/kg梯度組Sr峰值為正常均值倍數(shù)上升至6.60~18.27，表明隨濃度的增加，Sr元素在耳石上的沉積明顯增強(qiáng)(表2)。

圖1 各梯度組牙鲆耳石定量線分析

2.2 各梯度組牙鲆耳石上鍶元素的面分布

對(duì)標(biāo)記后恢復(fù)30 d的對(duì)照組、1、8、64 g/kg梯度組Sr元素在耳石上沉積的面分布進(jìn)行上機(jī)分析，結(jié)果見圖2。對(duì)照組和1 g/kg梯度組耳石上未出現(xiàn)“高鍶環(huán)帶”。8 g/kg和64 g/kg梯度組均出現(xiàn)了紅色“高鍶環(huán)帶”，與耳石本底顏色對(duì)比明顯。即8 g/kg和64 g/kg梯度組可對(duì)牙鲆幼魚耳石進(jìn)行明顯Sr元素指紋標(biāo)記。但64 g/kg梯度組“高鍶環(huán)帶”較8 g/kg梯度組的寬，且64 g/kg梯度組“高鍶環(huán)帶”外延至耳石邊緣顏色較8 g/kg梯度組的黃，Sr含量較8 g/kg梯度組的高。

表2 不同濃度組牙鲆耳石Sr/Ca比值微化學(xué)變化

Tab.2 Fluctuation of Sr/Ca microchemistry in otoliths of Japanese flounder (P. olivaceus) from different concentration groups

注：Ⅰ為Sr/Ca比值相對(duì)穩(wěn)定階段，Ⅱ?yàn)镾r/Ca比值顯著變化階段，Ⅲ為Sr/Ca比值顯著變化階段的最高峰值，Ⅳ為Sr/Ca比值顯著變化后恢復(fù)階段。同列不同上標(biāo)字母表示差異顯著(<0.05)

ote: Ⅰ: Stabilization stage of Sr/Ca ratio in otoliths; Ⅱ: Stage ofSr/Ca ratio significantly changed in otoliths; Ⅲ: Peak value of Sr/Ca ratio in otoliths; Ⅳ: Stage ofSr/Ca ratio after significantly changed in otoliths. Values in the same column with different letters are significantly different (<0.05)

2.3 生長與死亡

由表3可知，標(biāo)記實(shí)驗(yàn)前各梯度組全長差異不顯著(>0.05)；恢復(fù)30 d，1和8 g/kg梯度組全長差異不顯著，對(duì)照組、64 g/kg梯度組全長差異不顯著，1、8 g/kg梯度組牙鲆全長顯著大于對(duì)照組、64 g/kg梯度組全長差異顯著(<0.05)。標(biāo)記期間，各梯度組均未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)魚死亡。

3 討論

3.1 耳石鍶標(biāo)記及檢測(cè)方法

耳石具有非細(xì)胞性和代謝惰性，即使在饑餓時(shí)也不會(huì)發(fā)生重吸收，沉積在耳石中的生境元素能永久性保存(熊瑛等, 2015)。因此，人為適當(dāng)改變魚類周圍環(huán)境或食物中的元素含量極可能在耳石上產(chǎn)生元素標(biāo)記，并永久保存。Judd等(1965)利用火焰發(fā)射光譜法將Sr元素檢測(cè)極限降至0.1 μg/ml以下，使Sr元素作為一種標(biāo)記元素成為可能。

但有報(bào)道稱，隨著標(biāo)記魚的生長，Sr的相對(duì)含量逐漸下降，最終造成Sr標(biāo)記消失。如Yamada等(1979)對(duì)銀大麻哈魚()進(jìn)行Sr標(biāo)記時(shí)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記結(jié)束后，處理組Sr含量是對(duì)照組的32倍，秋季回捕時(shí)處理組是對(duì)照組的1.4倍，生長至成魚后，處理組與對(duì)照組無法區(qū)分。Steven等(1995)也報(bào)道了此現(xiàn)象。其原因?yàn)樵游展庾V法(AAS)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等檢測(cè)方法只能檢測(cè)均一化后的整體耳石樣品。因此，隨著魚體成長，耳石上Sr標(biāo)記部分所占比重越來越少，從而限制了耳石上Sr標(biāo)記檢出的效果。與之相比，EPMA可以精確分析耳石剖面上的不同位置的Sr含量沉積情況，從而不受標(biāo)記魚生長等限制，可避免上述局限。通過定量線分析可以準(zhǔn)確確定標(biāo)記位置及標(biāo)記Sr含量的波動(dòng)；通過面分布可直觀測(cè)到Sr標(biāo)記環(huán)寬窄、濃度的高低、標(biāo)記位置等，是一種檢測(cè)耳石元素指紋標(biāo)記的有效方法。

圖2 不同濃度組牙鲆耳石恢復(fù)30日鍶沉積狀況面分布

表3 不同Sr濃度組牙鲆全長變化情況(=30)

Tab.3 Variations of total length of Japanese flounder (P. olivaceus) from different Sr concentration groups (n=30)

注：同行不同上標(biāo)字母表示差異顯著(<0.05)

Note: Values in the same row with different letters are significantly different (<0.05)

耳石Sr標(biāo)記可在魚類胚胎、仔稚魚、幼魚及成魚等不同階段標(biāo)記，對(duì)標(biāo)記魚死亡及生長影響很小，操作簡(jiǎn)單，勞動(dòng)強(qiáng)度小，適合大規(guī)模標(biāo)記。耳石Sr標(biāo)記不受年齡、生長等影響，可通過多次標(biāo)記、不同發(fā)育階段或結(jié)合其他元素標(biāo)記等方法，區(qū)分不同年份不同單位放流魚，應(yīng)用前景廣闊。

3.2 不同劑量外源鍶對(duì)鍶標(biāo)記的影響

魚類通過周圍水環(huán)境或食物兩種途徑，將元素?cái)z入體內(nèi)，經(jīng)過一系列的代謝、循環(huán)沉積到耳石上 (付自東等, 2007; 王臣等, 2015; Troy, 2016)。因此，Sr標(biāo)記可以通過浸泡和投喂兩種方式完成。張輝等(2015)采用Sr含量為12 mg/L的海水標(biāo)記大黃魚() 7 d，標(biāo)記出現(xiàn)在距離耳石核心的0.65~0.80 mm處耳石區(qū)段。王臣等(2015)研究表明，外源50~400 mg/L濃度的Sr均能在大麻哈魚()耳石上大量沉積，50~200 mg/L濃度組Sr/Ca比值極大值逐漸升高，而400 mg/L低于200 mg/L組極大值。投喂法Sr標(biāo)記在溯河性魚類和淡水魚類中研究較多，檢測(cè)對(duì)象多為鱗片、脊椎骨和鰓蓋骨。Ophel等(1968)研究發(fā)現(xiàn)，以每400 g濕飼料中含32 g乳酸鍶為標(biāo)記飼料，投喂21 d，標(biāo)記金魚()的鱗片，含Sr量大概是對(duì)照組的10倍。Yamada等(1979)以16月齡的銀大麻哈魚為研究對(duì)象，連續(xù)投喂10000 mg/L鍶標(biāo)記飼料60 d后形成Sr標(biāo)記，其脊椎骨Sr含量是對(duì)照組的32倍。Guillou等(1987)研究發(fā)現(xiàn)，全長20~23 cm溪紅點(diǎn)鮭()攝食200~3200 μg Sr/g的標(biāo)記飼料6周，Sr可對(duì)溪紅點(diǎn)鮭鰓蓋骨標(biāo)記，且鰓蓋骨Sr含量隨標(biāo)記飼料Sr含量增加而增多；同時(shí)其還發(fā)現(xiàn)投喂6周200 μg Sr/g含量的標(biāo)記飼料，鰓蓋骨Sr含量約是對(duì)照組的5倍，但投喂4周相同Sr含量的標(biāo)記飼料，鰓蓋骨Sr含量增長不顯著。但投喂法耳石Sr標(biāo)記在海水魚類中的應(yīng)用未見報(bào)道。本研究首次采用投喂法對(duì)海水魚進(jìn)行耳石Sr標(biāo)記，研究發(fā)現(xiàn)，1 g/kg梯度組牙鲆耳石未出現(xiàn)Sr標(biāo)記，8、64 g/kg梯度組牙鲆耳石均形成Sr標(biāo)記，且64 g/kg梯度組Sr/Ca比極大值較8 g/kg梯度組大，其標(biāo)記環(huán)較8 g/kg梯度組寬。由此可知，首先，通過餌料進(jìn)行標(biāo)記需要外源Sr達(dá)到一定劑量后才能在耳石上形成有效地標(biāo)記；其次，在一定劑量范圍內(nèi)，Sr沉積隨外源Sr劑量的增加而增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同梯度組Sr標(biāo)記位置不同，相同梯度組Sr標(biāo)記數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。如8 g/kg梯度組Sr/Ca比值極大值位于距耳石核心838 μm左右，64 g/kg梯度組Sr/Ca比值極大值位于距耳石核心664 μm左右。又如，8 g/kg梯度組2個(gè)樣本Sr/Ca比值極大值分別位于距耳石核心848、828 μm處等。一方面高濃度組較低濃度組可能更早的在魚體內(nèi)富集到一定濃度水平的Sr，從而較早的在耳石上反映出來，另一方面高濃度組也會(huì)導(dǎo)致魚體內(nèi)外源Sr濃度較高，使得其恢復(fù)時(shí)間也要長于低濃度組。

3.3 鍶標(biāo)記對(duì)于標(biāo)記魚生長死亡的影響

穩(wěn)定Sr是一種對(duì)魚類無害的元素(Yamada, 1979)，Skov等(2001)研究發(fā)現(xiàn)，白斑狗魚()在1500 mg/L氯化鍶溶液中浸泡23 h，不影響其死亡率。張輝等(2015)研究表明，加入6 mg/L鍶的標(biāo)記組與對(duì)照組死亡尾數(shù)差異不顯著，并指出了低濃度Sr標(biāo)記大黃魚是可行的。本研究發(fā)現(xiàn)，處理組和對(duì)照組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，即氯化鍶對(duì)魚類來說是安全的。因此，從標(biāo)記魚死亡率和安全角度考慮，Sr標(biāo)記也是可行的。

通過對(duì)不同梯度組生長數(shù)據(jù)分析可知，在初始全長無差異的前提下，處理組投喂含Sr飼料后，生長發(fā)生了變化，雖然變化不大，但經(jīng)Duncan多重比較，低劑量梯度組(1、8 g/kg組)較高劑量梯度組及對(duì)照組生長快，且差異顯著(<0.05)。宋洪建(2013)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Sr濃度為10 mg/L時(shí)，大麻哈魚稚魚的各項(xiàng)生長指標(biāo)最高。因此，可以推斷在適宜的范圍內(nèi)，一定劑量的Sr可促進(jìn)魚類生長。然而，宋洪建(2013)通過Sr對(duì)大麻哈魚稚魚的生長、存活率、肌肉抗氧化酶、ATP酶及AKP酶活性、肝臟及腎臟組織影響研究發(fā)現(xiàn)，隨著Sr濃度的升高，Sr開始對(duì)肝組織產(chǎn)生一些毒副作用。Snyder等(1992)研究指出，高劑量Sr可導(dǎo)致虹鱒()稚魚眼組織白內(nèi)障。因此，在實(shí)際標(biāo)記工作中，建議選擇低劑量Sr標(biāo)記為宜。而結(jié)合本研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，8 g/kg的飼料標(biāo)記濃度是牙鲆耳石Sr標(biāo)記的較為可行且效果明顯的濃度。

綜上所述，以投喂標(biāo)記飼料的方式對(duì)牙鲆耳石Sr標(biāo)記是可行的。類似的耳石元素指紋標(biāo)記應(yīng)該可對(duì)擬放流魚類苗種進(jìn)行大規(guī)模標(biāo)記，且一旦標(biāo)記成功將不會(huì)受外界影響，并一生保存。理論上，耳石元素指紋標(biāo)記成本低，標(biāo)記方法簡(jiǎn)便易操作，對(duì)放流苗種損傷小。通過耳石微化學(xué)分析，可區(qū)分放流群體和野生群體，反演放流群體放流后生活史，為有效評(píng)估放流效果提供有力技術(shù)支撐。但在后續(xù)的工作中還需進(jìn)一步優(yōu)化標(biāo)記時(shí)間，探索多次鍶標(biāo)記、不同元素組合標(biāo)記等方法制備特有元素指紋標(biāo)記，以期大規(guī)模標(biāo)記不同地域、不同年份放流牙鲆，為科學(xué)評(píng)估牙鲆放流效果奠定基礎(chǔ)，為海水魚類標(biāo)記放流提供數(shù)據(jù)支撐。

Chen RY, Wang GX, Liu HJ,. Difference in parental contribution to reproduction in Japanese flounder (). Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(4): 698–705 [陳睿毅, 王桂興, 劉海金, 等. 牙鲆親本對(duì)子代貢獻(xiàn)率的實(shí)驗(yàn)研究. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20(4): 698–705]

Dou SZ, Yokouchi K, Yu X,. Reconstructing migratory history of fish using otolith strontium: Calciums ratios by EPMA: A case study. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2011, 42(4): 512–520 [竇碩增, 橫內(nèi)一樹, 于鑫, 等. 基于EPMA的耳石Sr : Ca比分析及其在魚類生活履歷反演中的應(yīng)用實(shí)例研究. 海洋與湖沼, 2011, 42(4): 512–520]

Fu ZD, Xie TM, Song ZB. Studies on elemental fingerprints in otolith of fish. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2007, 13(2): 278–283 [付自東, 謝天明, 宋昭彬. 魚類耳石元素指紋研究進(jìn)展. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2007, 13(2): 278–283]

Guillou A, Noüe JD. Use of strontium as a nutritional marker for farm-reared brook trout. Progressive Fish-Culturist, 1987, 49: 34–39

Judd JM, Coveart AE. Flame emission spectrophotometric method for the determination of stable strontium and calcium in fish. Atomic Energy of Canada Limited, 1965, 2518: 21

Li XQ, Cong XR, Shi JH,. Feasibility analysis of releasing individuals ofidentification based on otolith Sr markers. Journal of Lake Sciences, 2017, 29(4): 914–922 [李秀啟, 叢旭日, 師吉華, 等. 耳石鍶標(biāo)記在識(shí)別鳙()放流個(gè)體的可行性. 湖泊科學(xué), 2017, 29(4): 914–922]

Liu LL. Status of marine fishery resources enhancement and release in Shandong and the primary study of SD simulation. Master′s Thesis of Ocean University of China, 2007 [劉莉莉. 山東省海洋漁業(yè)資源增殖放流的發(fā)展現(xiàn)狀及其SD仿真的初步研究. 中國海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2007]

Liu Q. Japanese flounder marking techniques and juveniles released for stock enhancement. Master′s Thesis of Ocean University of China, 2009 [劉奇. 褐牙鲆標(biāo)志技術(shù)與增殖放流試驗(yàn)研究. 中國海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2009]

Liu YX, Yang RQ, Liu Y,. Use of microsatellite DNA profiling to identify Japanese flounder,of hatchery origin. Journal of the World Aquaculture Society, 2017, 48(2): 353–359

Liu ZL, Xu YJ, Liu XZ,. Tagging of Japanese flounder using T-bar tags. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(6): 80–86 [劉芝亮, 徐永江, 柳學(xué)周, 等. T型標(biāo)志牌標(biāo)記牙鲆苗種. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(6): 80–86]

Luo G, Zhuang P, Zhao F,. Development status existing issues and countermeasure in the selection of suitable species for stock enhancement. Marine Fisheries, 2016, 38(5): 551–560 [羅剛, 莊平, 趙峰, 等. 我國水生生物增殖放流物種選擇發(fā)展現(xiàn)狀、存在問題及對(duì)策. 海洋漁業(yè), 2016, 38(5): 551–560]

Ophel IL, Judd JM. Marking fish with stable strontium. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1968, 25(7): 1333–1337

Schroder SL, Knudsen CM, Volk EC. Marking salmon fry with strontium chloride solutions. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1995, 52: 1141–1149

Sekino M, Saitoh K, Yamada T,. Genetic tagging of released Japanese flounder () based on polymorphic DNA markers. Aquaculture, 2005, 244: 49–61

Skalski JR, Buchanan RA, Griswold J,. Review of marking methods and release-recapture designs for estimating the survival of very small fish: Examples from the assessment of salmonid fry survival. Reviews in Fisheries Science, 2009, 17(3): 391–401

Skov C, Gr?nkj?r P, Nielsen C. Marking pike fry otoliths with alizarin complexone and strontium: An evaluation of methods. Journal of Fish Biology, 2011, 59(3): 745–750

Snyder RJ, McKeown BA, Colbow K,. Use of dissolved strontium in scale marking of juvenile salmonids: Effects of concentration and exposure time. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1992, 49: 788–782

Song HJ. Allometric growth of chum salmon larvae and effects of strontium on physiological indices of their juveniles. Master′s Thesis of Northeast Agricultural University, 2013 [宋洪建. 大麻哈魚仔魚異速生長和鍶對(duì)其稚魚生理指標(biāo)的影響. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2013]

Song N, Gao TX, Han G. Application of molecular marker in fishery stock enhancement. Chinese Fisheries Economics, 2010, 28(3): 111–117 [宋娜, 高天翔, 韓剛. 分子標(biāo)記在漁業(yè)資源增殖放流中的應(yīng)用. 中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì), 2010, 28(3): 111–117]

Steven LS, Curtis MK, Eric CV. Marking salmon fry with strontium chloride solutions. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1995, 52: 1141–1149

Tong AP, Si F, Liu HJ,. Application of mtDNA and microsatellite markers to distinguish the released or non- released Japanese flounder. Journal of Fishery Sciences of China, 2015, 22(4): 630–637 [童愛萍, 司飛, 劉海金, 等. mtDNA和微衛(wèi)星標(biāo)記在放流牙鲆和非放流牙鲆鑒定中的應(yīng)用. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2015, 22(4): 630–637]

Tong AP. Application of mtDNA and microsatellite markers in Japanese flounder stock enhancement. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2015 [童愛萍. mtDNA和微衛(wèi)星標(biāo)記在放流牙鲆中的應(yīng)用研究. 上海海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2015]

Troy J, Morgan HB, Thomas PQ. Can dietary reliance on Pacific salmon eggs create otolith Sr/Ca signatures that mimic anadromy in resident salmonids? Environmental Biology of Fishes, 2016, 99: 237–247

Wang C, Liu W, Zhan PR,. Exogenous Sr2+sedimentation on otolith of chum salmon embryos. Chinese Journal of Applied Ecology, 2015, 26(10): 3189–3194 [王臣, 劉偉, 戰(zhàn)培榮, 等. 外源Sr2+在大麻哈魚胚胎耳石上的沉積. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 26(10): 3189–3194]

Wang YK. Preliminary studies on the population ecology based on fish otolith microstructure and microchemistry. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2015 [王玉堃. 耳石微細(xì)結(jié)構(gòu)和微化學(xué)示蹤技術(shù)在魚類種群生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用. 中國海洋大學(xué)博士研究生學(xué)位論文, 2015]

Wu HZ, Ruan HC, Wang XC,. Studies on the ecological basis of resources multiplication and stocking experiment on the false halibutin Jiaozhou Bay. Marine Sciences, 1987, 6: 52–53 [吳鶴洲, 阮洪超, 王新成, 等. 膠州灣牙鲆資源增殖的生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)及種苗放流實(shí)驗(yàn)研究. 海洋科學(xué), 1987, 6: 52–53]

Xiong Y, Liu HB, Tang JH,. Application of otolith microchemistry on reconstruction of migratory patterns and stock discrimination in marine fishes. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2015, 27(7): 953–959 [熊瑛, 劉洪波, 湯建華, 等. 耳石微化學(xué)在海洋魚類回游類型和種群識(shí)別研究中的應(yīng)用. 生命科學(xué), 2015, 27(7): 953–959]

Xu YJ, Liu XZ, Zhang K,. Tagging juvenile Japanese flounder () with coded wire tags. Progress in Fishery Sciences, 2017, 38(1): 168–174 [徐永江, 柳學(xué)周, 張凱, 等. 編碼金屬標(biāo)簽對(duì)牙鲆苗種標(biāo)記的效果. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2017, 2017, 38(1): 168–174]

Yamada SB, Mulligan TJ, Fairchild SJ. Strontium marking of hatchery-reared coho salmon (, Walbaum). Journal of Fish Biology, 1979, 14: 267–275

Yu GB, Li G. The technology of seed rearing of Japanese flounder based on ecology mark. China Fisheries, 2016(7): 102–105 [于廣寶, 李剛. 牙鲆生態(tài)標(biāo)記放流魚苗培育技術(shù). 中國水產(chǎn), 2016(7): 102–105]

Zhang H, Jiang YZ, Yuan XW,. Strontium marking on otolith of. Journal of Fishery Sciences of China, 2015, 22(6): 1270–1277 [張輝, 姜亞洲, 袁興偉, 等. 大黃魚耳石鍶標(biāo)志技術(shù). 中國水產(chǎn)科學(xué), 2015, 22(6): 1270–1277]

Zhang XM, Wang XJ, Tu Z,. Current status and prospect of fisheries resource enhancement in Shandong Province. Chinese Fisheries Economics, 2009, 2(27): 51–58 [張秀梅, 王熙杰, 涂中, 等. 山東省漁業(yè)資源增殖放流現(xiàn)狀與展望. 中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì), 2009, 2(27): 51–58]

Zhu XW, Xu YJ, Liu XZ,. Physiological mechanisms for degeneration of blind-side hypermelanosis in pond-cultured Japanese flounder (). Progress in Fishery Sciences, 2017, 38(1): 103–110 [朱學(xué)武, 徐永江, 柳學(xué)周, 等. 池塘養(yǎng)殖牙鲆()無眼側(cè)體色黑化消褪機(jī)理. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2017, 38(1): 103–110]

Use of Strontium Chloride in Otolith Marking of Japanese Flounder

SI Fei1, WANG Qinglin1, YU Qinghai1, LIU Hongbo2, JIANG Tao2, YANG Jian2, WANG Jun3①

(1. Beidaihe Central Experiment Station, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qinhuangdao 066100; 2. Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081; 3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Shandong Provincial Key Laboratory of Fishery Resources and Ecological Environment, Qingdao 266071)

In the management of stock enhanced Japanese flounder, it is often necessary to distinguish those that are hatchery-reared, from wild stocks. This study examines the feasibility of marking Japanese flounder by feeding them a diet enriched with strontium. To achieve nominally different concentrations of strontium in the fish food, 1, 8, and 64 g of strontium chloride crystals (SrCl2?6H2O) were each dissolved in 1 L of distilled water and sprayed onto 1 kg of pelleted feed. The treatments groups of fish were fed the pellets for 10 d, then farmed for 30 days, and then sampled. Our data shows that both the 8 g SrCl2/kg feed and 64 g SrCl2/kg feed resulted in a mark on the otoliths of the Japanese flounder. The peak concentration of strontium (8 g SrCl2/kg), often resulted in otoliths with concentrations two orders of magnitude higher than those found in the control fish. The concentration of strontium in the 64 g SrCl2/ kg feed, resulted in a 6-fold or 18-fold increases in the otoliths. The strontium value increased with the increased concentration of strontium in the pellet feed. The results also showed that strontium was safe for the fish and did not negatively affect their mortality. The total body length of the treatment groups with 1 and 8 g SrCl2/kg, were (11.11±1.32) cm and (10.88±1.07) cm, respectively, in which the length growth rate was faster than that of the control group and the treatment group with 64 g SrCl2/kg feed (≤0.05). With appropriate strontium concentrations, the growth of the Japanese flounder youth was enhanced. Our results suggest that feeding a diet enriched in strontium could be an effective means of marking hatchery-reared Japanese flounder for stock enhancement.

Strontium marking; Otolith; Japanese flounder

WANG Jun, E-mail: wangjun@ysfri.ac.cn

* 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303050)資助[This work was supported by Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest (201303050)]. 司 飛，E-mail: 15032316117@163.com

王 俊，研究員, E-mail: wangjun@ysfri.ac.cn

2018-05-29,

2018-06-15

S931.1

A

2095-9869(2019)04-0065-08

司飛, 王青林, 于清海, 劉洪波, 姜濤, 楊健, 王俊. 基于投喂法的牙鲆耳石鍶標(biāo)記. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(4): 65–72

Si F, Wang QL, Yu QH, Liu HB, Jiang T, Yang J, Wang J. Use of strontium chloride in otolith marking of Japanese flounder. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 65–72

(編輯 馮小花)