劉夢玲 沈紅藝 李中平 李 娟 劉 霞

上海中醫(yī)藥大學(xué)健康營養(yǎng)研究室 (上海， 201203)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)生、發(fā)展包括一系列的病變，由最初的脂肪變性、脂肪沉積到非酒精性脂肪性肝炎(NASH),進(jìn)一步發(fā)展可伴有纖維化、肝硬化，甚至有更加不良的預(yù)后[1]。因此，NASH是NAFLD發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點和限速環(huán)節(jié)。目前，對于NASH的治療臨床上雖然已有大量的研究，但治療常伴有一定的副作用[2]。甘薯又名紅芋、紅薯等,甘薯膳食纖維(SPDF)是甘薯的提取物。研究表明，甘薯膳食纖維能夠顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及其相關(guān)危險因素，減少體重和脂肪，改善脂質(zhì)分布，調(diào)節(jié)能量消耗[3]。本實驗從腸肝軸的角度，利用高脂飲食聯(lián)合聚糖硫酸鈉鹽(DSS)建立NASH動物模型，探究SPDF對NASH小鼠的可能藥理作用及機制，為SPDF對NASH的干預(yù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠30只，SPF級，6周齡，體重(20.200±0.965)g,購自上海西普爾-必凱實驗動物中心。實驗動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑 SPDF(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，170213)； DSS(Sigma，BCBT1747)； LPS ELISA試劑盒(Sigma，L5293)；BCA蛋白測定試劑盒(翌圣生物科技有限公司，B37150)；β-actin(proteintech，00056904)；ZO-1(proteintech，00055677)；Occludin(proteintech，00051604)；Claudin-1(proteintech，00043676)；山羊Anti-Rabbit二抗(Abcam，GR324800-3)；ECL顯影液(新賽美生物科技有限公司,171010146)。

1.3 主要儀器 電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A1004)；光吸收全波長酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司，SpectraMax 190)；高速勻漿機(方科儀器(常州)有限公司，F(xiàn)SH-2A)；蛋白凝膠成像儀(上海天能科技有限公司，Tanon-4200)；轉(zhuǎn)移搖床(其林貝爾，TS-2)；高速低溫離心機(Eppendorf , 5424 R)；伯樂電泳儀(Bio-Rad，Mini-PROTEAN 1658001)；全自動生化分析儀(西門子，ADVIA2400)。

1.4 動物分組、造模及給藥方法 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行實驗，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組(C組, 10只)、模型組(M組, 10只)、膳食纖維組(SPDF組,10只)。C組小鼠予以普通飼料喂養(yǎng)；M組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)的同時，自由飲用含1% DSS的飲用水，每7 d改正常飲用水10 d，以此循環(huán)至實驗結(jié)束；SPDF組小鼠在造模的同時以0.7 g/(kg·d)膳食纖維懸濁液灌胃，C組、M組小鼠予等劑量生理鹽水灌胃。實驗持續(xù)12周。

1.5 取材及指標(biāo)測量 實驗結(jié)束后，小鼠禁食12 h，稱體重、摘眼球取血，取血后靜置2 h，4℃ 3 000 rpm離心10 min，取上清液備用。頸脫位法處死小鼠，采集肝臟和回腸，肝臟稱取重量后，取右葉0.2 cm×0.2 cm大小肝臟組織和部分回腸組織于10%中性福爾馬林溶液中固定備用，剩余肝臟組織及回腸組織液氮中固定后保存于-80℃冰箱以備檢測。血清TC、TG、LPS含量測定參照試劑盒說明書操作。

1.6 蛋白表達(dá)量： 腸道ZO-1、Occludin、Claudin-1表達(dá)量按試劑盒說明書提取回腸組織蛋白，測定蛋白含量。取蛋白質(zhì)樣品15 μg，進(jìn)行SDS-PA電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別用ZO-1、Occludin、Claudin-1抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜，隔日用二抗(1:2000)室溫孵育1 h，ECL曝光顯影，蛋白凝膠成像儀Tanon-4200掃描，Image J軟件分析結(jié)果。以β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的對比值表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗過程中，由于灌胃不當(dāng)3組小鼠各死亡1只。余下小鼠中，C組小鼠活動正常，毛發(fā)平整，飲食正常；M組小鼠肥胖嗜睡，毛發(fā)粗糙凌亂，精神萎靡；SPDF組小鼠活動及飲食減少，毛發(fā)欠光滑。

2.2 各組小鼠肝臟病理學(xué)檢測結(jié)果 肝臟HE染色光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，C組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈條索狀排列；M組小鼠肝臟組織可見廣泛的脂肪,肝細(xì)胞可見氣球樣變，伴炎癥細(xì)胞浸潤；SPDF組小鼠肝臟脂肪變性程度明顯減輕，脂滴數(shù)量也明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少(見插頁圖1、圖2)。

2.3 各組小鼠體重、肝重及肝指數(shù)情況 見表1。

表1 各組小鼠體重、肝重、肝指數(shù)比較

2.4 各組小鼠血清TC、TG、LPS檢測情況 見表2。

表2 各組小鼠血清TC、TG、LPS檢測情況

2.5 各組小鼠腸道組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表達(dá)情況 見圖3。

與C組比較，##P<0.01；與M組比較，** P<0.01

3 討論

近年來，NAFLD發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，NAFLD可沿著NASH進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化等晚期肝病。因此，對NASH的早期干預(yù)是防止病變繼續(xù)惡化的關(guān)鍵節(jié)點[4,5]。關(guān)于NASH的發(fā)病機制，近年來由“二次打擊”學(xué)說發(fā)展為“多重打擊”學(xué)說，多重打擊包括脂毒性、線粒體功能失調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、腸源性內(nèi)毒素等[6]。在這些發(fā)病機制中，腸源性內(nèi)毒素在NASH中發(fā)揮著的作用越來越引起人們的關(guān)注。基于腸肝軸解剖關(guān)系的存在，一方面腸黏膜屏障功能受損，腸源性內(nèi)毒素進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)；另一方面，入血后的內(nèi)毒素首過肝臟，激活肝臟巨噬細(xì)胞，釋放一系列炎性因子，肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，使肝臟處于炎癥狀態(tài)[7]。腸黏膜屏障受損、腸壁通透性增加，促進(jìn)肝臟炎癥的發(fā)生和發(fā)展；而肝臟炎癥也可以反過來加重腸屏障功能失調(diào)等，兩者相互影響、互為因果。

腸上皮細(xì)胞的緊密連接是腸黏膜機械屏障的關(guān)鍵組成部分，在維持腸屏障的完整性和通透性的平衡方面起著重要的作用。緊密連接是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，其中，ZO-1作為連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的橋梁，它的分布和表達(dá)變化同樣影響緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能[8,9]；上皮細(xì)胞通過Occludin蛋白封閉細(xì)胞間隙[10]；Claudins可調(diào)節(jié)溶質(zhì)在極化上皮細(xì)胞中的運動[11]。

甘薯屬旋花科是一年或多年生蔓生草本，富含膳食纖維，能加快消化道蠕動，有助清理消化道，同時膳食纖維能夠吸收一部分葡萄糖，使血液中含糖量減少，有助于預(yù)防代謝性疾病[12]。實驗研究表明，SPDF可抑制二甲基肼引起的機體氧化應(yīng)激，減少腸細(xì)胞氧化損傷，減少結(jié)腸癌的發(fā)生機會，具有抗氧化、抗癌的作用[13]。此外，SPDF能降低大鼠肝臟脂質(zhì)含量，提高大鼠胰島素和瘦素敏感性，降低大鼠血漿中FFA、TNF-α和IL-6的水平，改善脂肪細(xì)胞因子水平、促炎狀態(tài)和胰島素信號傳導(dǎo)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，SPDF有助于改善NASH，可能作用機制是通過增加腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，改善腸屏障的作用，繼而抑制腸源性內(nèi)毒素對肝臟的炎性刺激。

甘薯膳食纖維可以看做是甘薯藥食兩用的營養(yǎng)素。本研究為SPDF防治NASH提供了一定的實驗依據(jù)，對于這一廣泛存在的營養(yǎng)素的運用具有參考價值。