馬光朝 胡 棣 浦仕彪

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 (云南 昆明， 650500)

自身免疫性肝炎(AIH)是自身免疫性肝病(AILD)中較為常見的一型疾病，是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，由異常自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的嚴(yán)重的進(jìn)行性疾病。流行病學(xué)研究顯示，AIH病情反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，發(fā)病率逐年升高[1, 2]。免疫抑制劑為AIH的首選治療藥物，潑尼松(龍)單一治療或加用硫唑嘌呤聯(lián)合治療被公認(rèn)為是AIH的基礎(chǔ)治療，并被臨床廣泛應(yīng)用，但長期應(yīng)用不良反應(yīng)明顯，且停藥后復(fù)發(fā)率較高，不能滿足AIH臨床治療的需要[3～6]。大部分臨床報(bào)道提示中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療AIH具有療效顯著、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，充分應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合療法，使其優(yōu)勢互補(bǔ)是當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)和主要趨勢。針對(duì)AIH診斷血清抗體缺乏特異性、不能預(yù)示疾病預(yù)后的問題，前期課題組通過臨床研究發(fā)現(xiàn)代謝標(biāo)志物可以較好地預(yù)測疾病的預(yù)后[7]。因此，本課題旨在篩選濕熱蘊(yùn)結(jié)型自身免疫性肝炎的代謝標(biāo)志物，加強(qiáng)AIH的中醫(yī)證候?qū)W研究，以期形成病-證-藥一體化的中西醫(yī)結(jié)合治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2018年12月在我校門診部治療的AIH患者44例，女42例，男2例。將42例女性患者隨機(jī)分成對(duì)照組和治療組，各21例；2例男性患者分別入對(duì)照組和治療組，各1例。兩組分別給予糖皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素聯(lián)合中藥治療。另入選健康人群23例，男1例，女22例。見表1。

表1 臨床特征在研究對(duì)象間的比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 濕熱蘊(yùn)結(jié)型AIH患者的診斷參照國際自身免疫性肝炎小組1998年修訂的《AIH診斷及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》和《2010美國肝病學(xué)會(huì)自身免疫性肝炎診治指南》[8，9]。中醫(yī)辨證、癥狀評(píng)分參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》、《中醫(yī)診斷學(xué)》及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[10～12]。

1.3 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～70歲，診斷均符合上述標(biāo)準(zhǔn)，樣品采集前未經(jīng)特異性治療，簽署知情同意書，自愿參加本項(xiàng)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并病毒感染性疾病、藥物性肝炎、酒精性肝病等疾?。缓喜?yán)重的心腦血管、肝、腎、消化、造血系統(tǒng)等疾?。缓喜⒏腥炯俺鲅?；進(jìn)展性惡性腫瘤或其他嚴(yán)重消耗性疾??；意識(shí)不清、不能表達(dá)主觀不適癥狀以及精神病患者。

1.4 治療方法 對(duì)照組：潑尼松片口服，首次60 mg/d，每服藥7 d遞減劑量，直至每日20 mg，固定劑量服用，持續(xù)服用藥物3個(gè)月。治療組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上，同時(shí)服用中藥(茵陳、虎杖、赤芍、柴胡、青皮、木香、白術(shù)、敗醬草、云苓、麥芽)，1劑/d，水煎至200 ml，2次/d，早晚服用。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察治療前后AIH患者的肝功能、免疫學(xué)指標(biāo)、代謝標(biāo)志物、中醫(yī)癥狀積分及臨床療效。療效判定標(biāo)準(zhǔn)參照《2010美囯肝病學(xué)會(huì)自身免疫性肝炎指南》和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》。

1.6 儀器與試劑 600 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀 (INOVA，美國瓦里安公司)；冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；重水(D2O, 99.9%，德國Merek公司)；3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉(TSP，德國Merck公司)。

1.7 臨床樣本的處理 將血漿樣本從-80 ℃冰箱取出，4℃復(fù)融，吸取200 μl置于EP管中，加入400 μl D2O與之混合，12 000 轉(zhuǎn)/min 4℃離心10 min，取550 μl上清加入5 mm核磁管內(nèi)，即為備用樣品。

1.81H NMR檢測 運(yùn)用馳豫編輯脈沖序列(CPMG)采集血漿樣本數(shù)據(jù)，觀測血漿中的小分子代謝物。測定溫度設(shè)定為25℃，譜寬為8 000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64 k，采樣時(shí)間2 s，掃描次數(shù)128次，2 nτ為320 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對(duì)水峰進(jìn)行預(yù)飽和。對(duì)自由感應(yīng)衰減(FID)信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行填零，加上1Hz的線增寬因子后進(jìn)行傅立葉變換轉(zhuǎn)得到1H NMR譜圖，以乳酸甲基信號(hào)雙峰的左側(cè)峰定為δ1.33。

2 結(jié)果

2.1 代謝生物標(biāo)志物篩選 健康組志愿者與AIH患者血漿1H NMR譜圖的PLS-DA分析結(jié)果空間分布見圖1。模型質(zhì)量參數(shù)R2X=23.2%，R2Y=91.7%，表明擬合模型的準(zhǔn)確度及預(yù)測度均良好。選擇具有顯著性差異(P<0.05)且VIP>1，|P(corr)|>0.58對(duì)應(yīng)的代謝生物標(biāo)志物為濕熱蘊(yùn)結(jié)型AIH患者血漿代謝標(biāo)志物。見表2。

表2 濕熱蘊(yùn)結(jié)型AIH患者血漿代謝標(biāo)志物

圖1 AIH患者與健康志愿者PLS-DA得分圖

▲ AIH患者

■健康志愿者

2.2 生物標(biāo)志物對(duì)中西醫(yī)干預(yù)效應(yīng) 本研究采用治療前后代謝標(biāo)志物的峰面積變化趨勢來反映標(biāo)志物對(duì)中西醫(yī)干預(yù)效應(yīng)。結(jié)果顯示，兩種治療方法對(duì)濕熱蘊(yùn)結(jié)型AIH代謝標(biāo)志物均具有調(diào)節(jié)作用，其中對(duì)丙氨酸、組氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸呈上調(diào)趨勢。對(duì)檸檬酸、β-羥丁酸、?；撬?、乳酸、肌酸、乙酰乙酸、α-葡萄糖呈下調(diào)趨勢，對(duì)谷酰胺、膽堿調(diào)節(jié)作用不明顯。見表3。

表3 代謝標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用在兩種治療方法間的比較

2.3 兩組患者臨床療效 3個(gè)療程后，治療組顯效19例(86.36%)，有效3例(13.64%)，無效0例，顯效率為86.36%，總有效率為100%；對(duì)照組顯效13例(59.09%)，有效7例(31.82%)，無效2例(9.09%)，顯效率為59.09%，總有效率為90.91%。

2.4 中醫(yī)癥候積分判斷療效情況 按照中醫(yī)證候積分，判定臨床痊愈、顯效、有效、無效4項(xiàng)等級(jí)，以判定治療效果。治療組顯效19例(86.36%)，有效3例(13.64%)，無效0例，顯效率為86.36%，總有效率為100%；對(duì)照組顯效3例(13.64%)，有效6例(27.27%)，無效9例(40.91%)，顯效率為13.64%，總有效率為59.09%。

2.5 兩組患者治療前后肝功能檢測結(jié)果 見表4。

表4 治療前后兩組患者肝功能比較

2.6 兩組患者治療前后免疫球蛋白檢測結(jié)果 見表5。

表5 兩組患者治療前后免疫球蛋白比較

3 討論

AIH是嚴(yán)重的進(jìn)行性疾病，目前研究熱點(diǎn)主要集中于自身抗體、遺傳及組織學(xué)等領(lǐng)域。自身抗體，如抗核抗體、抗平滑肌抗體的檢測對(duì)于AIH的診斷有重要意義，是診斷的必要條件之一。但是多數(shù)自身抗體既無種屬或器官特異性，也無疾病特異性，不能預(yù)示疾病的預(yù)后，不少學(xué)者認(rèn)為不宜將自身抗體絕對(duì)水平及其變化作為判斷疾病嚴(yán)重程度或治療效果的指標(biāo)。從病與證的內(nèi)涵看，病是決定證的內(nèi)在穩(wěn)定因素，而證是病的外在綜合表現(xiàn)，證可隨著疾病的進(jìn)退而變化，本研究結(jié)果也從濕熱蘊(yùn)結(jié)型證相關(guān)代謝標(biāo)志物的變化情況佐證了證可隨著疾病的進(jìn)退而變化，代謝標(biāo)志物對(duì)AIH的預(yù)后及治療效果有一定的預(yù)示作用。乙酰乙酸、β-羥異丁酸含量與疾病的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系，從體內(nèi)代謝途徑來看，二者含量的升高預(yù)示著肝細(xì)胞的損害嚴(yán)重以及機(jī)體能量代謝的異常。谷酰胺是體內(nèi)最豐富的游離氨基酸之一，是重要的促免疫氨基酸，有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，是淋巴細(xì)胞分泌、增殖及其功能維持所必需的，其濃度升高可能提示AIH患者免疫功能紊亂。肌酸含量水平與疾病的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系，被認(rèn)為是評(píng)估肝臟損傷的一個(gè)非常靈敏的指標(biāo)。組氨酸含量與疾病的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系，檸檬酸是三羧酸循環(huán)的一系列反應(yīng)中的關(guān)鍵化合物，其含量水平的升高可能提示AIH患者機(jī)體三羧酸循環(huán)紊亂亢進(jìn)，并預(yù)示患者線粒體功能的紊亂。膽堿是細(xì)胞膜重要組成成分，肝硬化患者膽堿含量減少說明肝細(xì)胞再生活躍，這可能與肝纖維化形成有關(guān)。

對(duì)于AIH的治療，中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合療法在提高臨床療效、減輕不良反應(yīng)以及提高生活質(zhì)量等方面都有積極作用。中醫(yī)學(xué)對(duì)AIH的證候、病因、病機(jī)認(rèn)識(shí)尚未達(dá)成共識(shí)，對(duì)AIH的治療亦未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，本課題旨在篩選濕熱蘊(yùn)結(jié)型AIH的代謝標(biāo)志物，加強(qiáng)對(duì)AIH的中醫(yī)證候?qū)W研究。對(duì)于濕熱蘊(yùn)結(jié)型AIH的中醫(yī)治療，研究主要采用利濕逐瘀、疏肝健脾的治療方法，以通利肝膽、大腸之機(jī)，祛除濕邪瘀滯。從治療后臨床療效觀察來看，該組方對(duì)濕熱蘊(yùn)結(jié)型AIH的治療具有積極作用。