程 潔 谷建琦 張 棟 吳永生 袁 軍 胡玉敬

顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）是頜面部唯一的雙側(cè)聯(lián)動(dòng)關(guān)節(jié)，TMJ 的功能對(duì)咀嚼、吞咽、語言及面部表情等都有非常重要的意義。顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征是近年來臨床發(fā)病率很高的一類口腔科疾病，其病因機(jī)制復(fù)雜，與多種因素相關(guān)。近年來，顳頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征的發(fā)病年齡低齡化趨勢明顯，而發(fā)育期咬合關(guān)系的異常又是造成TMJ 疾病的重要病因之一，因此研究生長發(fā)育期的TMJ 疾病的致病機(jī)制有著重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)選取的3～8 周齡大鼠相當(dāng)于人類的青春發(fā)育期階段。雙側(cè)咬合關(guān)系不協(xié)調(diào)，咀嚼力不均衡，都會(huì)對(duì)顳頜關(guān)節(jié)造成不良負(fù)擔(dān)，可能會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡反應(yīng)的啟動(dòng)。凋亡蛋白caspase-12 和bak 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中的重要因子，但對(duì)其在偏側(cè)咀嚼引起的髁突軟骨變化中的作用機(jī)制的研究未見深入報(bào)道。本研究旨在通過大鼠造模單側(cè)磨牙缺失而致的單側(cè)咀嚼力降低，研究大鼠髁突軟骨細(xì)胞中凋亡蛋白caspase-12 和bak 的變化，進(jìn)一步探討其引起顳頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征的致病機(jī)制。

資料和方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組：使用河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供的3 周齡雄性SD 大鼠96 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為8 組，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各4組，每組12 只。

2.動(dòng)物模型的建立與取材：各實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)10%水合氯醛4mL/kg 腹腔注射麻醉后，固定頭部，行左側(cè)上、下頜所有磨牙拔除術(shù)，使得大鼠左側(cè)因后牙缺失而降低咀嚼力，分別于拔牙后1d，7d，14d，28d，每組取6 只，深度麻醉（1%戊巴比妥1mL/只）下打開胸腔，經(jīng)主動(dòng)脈插管，分別灌注生理鹽水（200mL/只）和多聚甲醛（40g/L，400mL/只），取出雙側(cè)髁突關(guān)節(jié)軟骨，于多聚甲醛中固定。另在每組中取動(dòng)物6 只，麻醉后直接取髁突軟骨凍存于-80℃冰箱中備用。對(duì)照組大鼠不做任何處理，與對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組同期處死并取材。

二、方法

1.蘇木精-伊紅染色（HE 染色）：取材組織塊經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm 切片。常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗，蘇木素染色5 分鐘，自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30 秒，自來水浸泡15 分鐘或溫水（約50℃）5 分鐘。置伊紅液2 分鐘。常規(guī)脫水，透明，中性樹脂封固。

2.實(shí)時(shí)定量PCR 檢測：取雙側(cè)髁突軟骨，于-80℃保存，用Trizol 提取組織樣本中總RNA。取5μl RNA 用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測RNA的完整性。用天根生物科技有限公司的TIANScript RT KIT 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin 用作內(nèi)定參考。PCR 反應(yīng)程序：95℃ 15min，95℃ 10s，58℃30s，72℃ 30s，循環(huán)40 次。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。引物序列見表1。

用熒光定量PCR 儀，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。根據(jù)RealTimePCR 原始檢測結(jié)果，按照 2-△△Ct相對(duì)定量計(jì)算公式，即：△△Ct＝[Ct目的基因（實(shí)驗(yàn)組）-CtBeta基因（實(shí)驗(yàn)組）]- [Ct目的基因（對(duì)照組）-CtBeta基因（對(duì)照組）]。計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對(duì)于對(duì)照樣品目的基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的差異。

表1 PCR 引物序列

3.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析法，比較不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)及對(duì)照組髁突軟骨caspase-12 和Bak 的表達(dá)情況，比較各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)同側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的caspase-12 和Bak的表達(dá)情況。

結(jié) 果

1.形態(tài)學(xué)觀察（HE 染色）：大鼠髁突軟骨分為纖維層，增殖層，肥大層及鈣化軟骨層。對(duì)照組中各層細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞排列整齊（圖1A）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)7 天時(shí)細(xì)胞排列出現(xiàn)紊亂，增殖層與肥大層界限開始模糊（圖1B）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)14 天時(shí)細(xì)胞排列紊亂更加明顯，肥大層與軟骨層細(xì)胞排列稀疏，可見胞核固縮（圖1C）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)28 天時(shí)出現(xiàn)表層纖維斷裂松解，細(xì)胞退行性變化，軟骨細(xì)胞可見核內(nèi)空泡性變（圖1D）。

圖1 HE 染色

2.RT-PCR 檢測結(jié)果：因?qū)φ战M髁突軟骨中caspase-12 和Bak 的含量在不同時(shí)間點(diǎn)的左右側(cè)對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），所以分別將不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的左、右側(cè)合并為一組。caspase-12 的含量在1d，7d，14d，28d 時(shí)實(shí)驗(yàn)組左側(cè)＞實(shí)驗(yàn)組右側(cè)＞對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)caspase-12 含量在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12 含量在 1d，7d，14d 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。隨拔牙時(shí)間的延長，對(duì)照組caspase-12 含量無明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組左側(cè)caspase-12 含量逐漸升高，在14d，28d 時(shí)升高較前一時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12 含量逐漸降低，在7d，28d 時(shí)降低較前一時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表2）。Bak 含量變化趨勢與 caspase-12相似，1d，7d，14d，28d 時(shí)實(shí)驗(yàn)組左側(cè)＞實(shí)驗(yàn)組右側(cè)＞對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)高于對(duì)照組非常明顯，各時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)在1d，7d，14d 時(shí)高于對(duì)照組（P＜0.05）。隨時(shí)間延長，對(duì)照組Bak 含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組左側(cè)Bak 含量逐漸升高（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)逐漸降低（P＜0.05），到28d 時(shí)與對(duì)照組已無顯著性差異（P＞0.05）。（表3）

表2 各組不同時(shí)間段的caspase-12 含量

表3 各組不同時(shí)間段的Bak 含量

討 論

髁突軟骨屬于繼發(fā)性軟骨，是下頜骨的生長發(fā)育中心，它既受局部因素的影響，又受生長因素的影響[1]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為適當(dāng)?shù)膲毫ω?fù)荷對(duì)于髁突軟骨的生長發(fā)育是有積極改建作用的，但其具體的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未研究清楚[2]，而不當(dāng)?shù)膲毫ω?fù)荷會(huì)導(dǎo)致髁突軟骨細(xì)胞的凋亡反應(yīng)[3]。

細(xì)胞的凋亡途徑主要有三種：①由細(xì)胞表面的死亡受體引發(fā)的外在途徑；②內(nèi)在途徑或稱線粒體途徑；③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所導(dǎo)致的caspase-12 的活化，從而導(dǎo)致凋亡。前兩種途徑研究的較為廣泛[4]，而第三種途徑在單側(cè)咀嚼力降低引起髁突軟骨凋亡的機(jī)制中的具體機(jī)理鮮有報(bào)道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)精細(xì)的膜系統(tǒng)，是蛋白質(zhì)合成和運(yùn)輸?shù)闹匾獔鏊鵞5]，它包含鈣調(diào)節(jié)分子伴侶，腔內(nèi)含有凋亡蛋白如caspase-12 和Bcl-2 等。鈣調(diào)節(jié)分子伴侶凋亡蛋白決定了細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的敏感性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子濃度與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有級(jí)聯(lián)關(guān)系，促凋亡蛋白Bak 和Bax 主要是通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的鈣離子濃度而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[6]。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，細(xì)胞將最終啟動(dòng)caspase-12 依賴的細(xì)胞凋亡程序。有實(shí)驗(yàn)[7]表明，caspase-12 缺陷鼠能抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細(xì)胞凋亡，而對(duì)其他凋亡途徑仍可引起細(xì)胞凋亡，說明caspase-12 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡有關(guān)。

咬合力的改變，會(huì)對(duì)髁突軟骨造成不同力值的機(jī)械刺激，從而改變髁突軟骨內(nèi)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的平衡關(guān)系。Sriram D[8]等通過對(duì)下頜骨髁突進(jìn)行不同力值和頻率的加載，顯示高頻率低量級(jí)的刺激會(huì)促進(jìn)髁突軟骨的適應(yīng)性重建，并出現(xiàn)軟骨內(nèi)成骨。很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外在應(yīng)力的改變，如果打破了髁突軟骨環(huán)境的平衡，則會(huì)導(dǎo)致其病理性改變，引起細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)[9～11]。

本研究的形態(tài)學(xué)觀察顯示，拔牙后，實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨隨時(shí)間推移，逐漸出現(xiàn)了明顯的軟骨退行性變，表現(xiàn)為各細(xì)胞分層逐漸模糊，纖維斷裂，軟骨細(xì)胞空泡性變等變化，說明實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了軟骨細(xì)胞的凋亡反應(yīng)。作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，caspase-12 的含量在實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)的各時(shí)間點(diǎn)均較對(duì)照組高，說明實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨因雙側(cè)咀嚼力不均衡，導(dǎo)致軟骨出現(xiàn)退化趨勢，而出現(xiàn)了caspase-12 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的凋亡反應(yīng)，這與以往的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[12～14]。而實(shí)驗(yàn)組Bak 含量的升高，增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放，激發(fā)了胞質(zhì)中的鈣依賴性蛋白酶，而鈣依賴性蛋白酶進(jìn)一步剪切并激活了caspase-12，促進(jìn)凋亡反應(yīng)的發(fā)生。因此，caspase-12和Bak 的升高是相輔相成的。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)caspase-12 和Bak 的含量隨時(shí)間延長表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12 和Bak 的含量隨時(shí)間延長而降低，1d 時(shí)實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，28d 時(shí)實(shí)驗(yàn)組右側(cè)與對(duì)照組的caspase-12 含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析原因，可能有兩點(diǎn)：①拔牙后1d，因拔牙引起的創(chuàng)傷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡被打破，因此實(shí)驗(yàn)組左、右兩側(cè)均表現(xiàn)為促凋亡因子的明顯升高，但創(chuàng)口使得大鼠進(jìn)食量降低，咀嚼減少，雙側(cè)的咬合力不均衡對(duì)髁突的影響尚未完全表現(xiàn)出來，因而實(shí)驗(yàn)組左、右兩側(cè)caspase-12 和Bak 的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②實(shí)驗(yàn)組左側(cè)后牙缺失，導(dǎo)致左側(cè)咀嚼力降低，左側(cè)的髁突在關(guān)節(jié)窩內(nèi)有向前移動(dòng)的趨勢，因此左側(cè)髁突軟骨受壓迫，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡反應(yīng)的活躍。而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)仍有較為穩(wěn)定的咬合關(guān)系，隨著炎癥的好轉(zhuǎn)，髁突軟骨因收到咀嚼刺激，發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性重建，因此促凋亡因子逐漸減少，到28d 時(shí)，其caspase-12含量與對(duì)照組已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

異常的咬合刺激，隨時(shí)間延長，軟骨出現(xiàn)逐漸加重的退化趨勢，軟骨細(xì)胞凋亡增加，基質(zhì)降解代謝增加[15，16]。咀嚼力降低對(duì)發(fā)育期大鼠髁突軟骨的細(xì)胞增殖無顯著性改變，但對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用，進(jìn)而影響髁突的正常發(fā)育[17]。Sato R[18]等研究發(fā)現(xiàn)軟食組大鼠因咀嚼力降低，髁突的應(yīng)力刺激減小，導(dǎo)致髁突軟骨中凋亡細(xì)胞增加。食物負(fù)荷的改變即髁突承受壓力的改變，對(duì)于髁突軟骨細(xì)胞的反應(yīng)都具有負(fù)荷依賴性和時(shí)間依賴性，或產(chǎn)生適應(yīng)性代謝反應(yīng)，或引發(fā)不可逆的凋亡反應(yīng)[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致，因此，臨床上應(yīng)對(duì)青少年期單側(cè)后牙缺失或牙體缺損導(dǎo)致咀嚼力降低予以足夠重視，警惕其造成進(jìn)一步關(guān)節(jié)損傷，引發(fā)以關(guān)節(jié)軟骨的破壞與耗損為主要特征的顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病發(fā)生。

綜上所述，單側(cè)咀嚼力降低導(dǎo)致大鼠髁突軟骨受力異常，引發(fā)促凋亡因子caspase-12 和Bak 的含量升高，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是髁突軟骨細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。