袁海鋒 陳東波 張建華 劉增福 劉慧亞 劉慶民

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)，近年來(lái)隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，預(yù)后不佳，總體生存率在50%左右[1-3]。因而，結(jié)直腸癌的預(yù)防成為最近研究的焦點(diǎn)[4-5]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，十字花科蔬菜能降低結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)[6-8]。油菜籽（rapeseed，RS）是十字花科蔬菜油菜的種子，含有豐富的脂肪酸、磷脂、多酚、維生素E、硫代葡萄糖苷、纖維素、植酸、黃銅等多種化學(xué)成分。研究發(fā)現(xiàn)，油菜籽具有殺菌消炎、抗衰老、抗過(guò)敏、抗癌防癌等功效[9]，但其對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)防作用還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題旨在研究油菜籽對(duì)小鼠結(jié)直腸癌的預(yù)防作用，以期為油菜籽應(yīng)用于腫瘤的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 致癌劑氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，臨用前用生理鹽水配制，終濃度為1.25 g/L。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018年4月—2019年3月，選取清潔級(jí)昆明種小鼠和和基礎(chǔ)飼料購(gòu)自菏澤醫(yī)專實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，油菜籽（rapeseed，RS）購(gòu)自菏澤某種子公司，在動(dòng)物中心將油菜籽和基礎(chǔ)飼料混勻，加工制成含2.5% RS和5% RS的飼料。昆明種小鼠80只，體質(zhì)量18～20 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，第2周開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22℃～25℃，濕度為40%～70%，自由飲水，自然光照。

1.1.3 醫(yī)學(xué)倫理學(xué) 該研究項(xiàng)目實(shí)施前報(bào)請(qǐng)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將80只昆明種小鼠隨機(jī)分為5組，分組如下：（1）AOM模型組（20只）：以無(wú)菌生理鹽水將AOM溶解，腹腔注射10 mg/kg體質(zhì)量，每周1次，共6次，基礎(chǔ)飼料飲食；（2）AOM+2.5% RS低劑量預(yù)防組（20只）：AOM誘發(fā)腫瘤同時(shí)給予含2.5% RS飼料飲食；（3）AOM+5% RS高劑量預(yù)防組（20只）：AOM誘發(fā)腫瘤同時(shí)給予含5% RS飼料飲食；（4）正常對(duì)照組（10只）：給予等體積生理鹽水腹腔注射，基礎(chǔ)飼料飲食；（5）單純油菜籽組（10只）：給予等體積生理鹽水腹腔注射，含5% RS飼料飲食。

1.2.2 觀察指標(biāo)和取材 觀察各組小鼠的一般狀態(tài)，包括營(yíng)養(yǎng)狀況、活動(dòng)狀態(tài)、大便性狀、精神狀態(tài)、毛發(fā)光滑程度，記錄體重。第36周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死小鼠，解剖腹腔，取出結(jié)直腸，沿腸系膜縱向剖開，用生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干，觀察有無(wú)腫瘤發(fā)生，計(jì)算腫瘤發(fā)生率。經(jīng)肉眼判斷為腫瘤或疑似腫瘤的標(biāo)本用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱片確診。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，多組間均數(shù)比較選用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料選用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（±s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

正常對(duì)照組和單純油菜籽組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，反應(yīng)靈敏，皮毛光滑，飲食和精神狀態(tài)良好；AOM模型組小鼠20周后部分小鼠出現(xiàn)攝食量減少，皮毛粗糙無(wú)光澤，28周時(shí)，大部分小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，精神狀態(tài)差，體質(zhì)量下降，36周時(shí)，部分小鼠出現(xiàn)腹部明顯膨隆，便血，個(gè)別小鼠發(fā)生腹水；各油菜籽預(yù)防組小鼠一般狀態(tài)好于腫瘤模型組小鼠。

2.2 體質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)期初，各組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)期末，單純油菜籽組與正常對(duì)照組比較，體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腫瘤模型組體質(zhì)量低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量和高劑量預(yù)防組體質(zhì)量均高于腫瘤模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1各組小鼠體質(zhì)量變化比較（g，±s）

表1各組小鼠體質(zhì)量變化比較（g，±s）

注：與實(shí)驗(yàn)初相比，*P＞0．05，與腫瘤模型組相比，#P＜0．05

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2.3 肉眼觀察

正常對(duì)照組和單純油菜籽組小鼠結(jié)直腸粘膜光滑平整，未見腫瘤及其它病變。腫瘤模型組和各油菜籽預(yù)防組小鼠結(jié)直腸粘膜發(fā)現(xiàn)大小不一、數(shù)量不等的腫瘤結(jié)節(jié)，主要分布在距肛門8 cm以內(nèi)的腸段，結(jié)節(jié)多為圓形、橢圓形，多數(shù)直徑約2～3 mm，表面光滑、質(zhì)韌，少數(shù)腫物表面可見潰爛。

2.4 腫瘤發(fā)生情況

在小鼠的結(jié)直腸中發(fā)現(xiàn)1個(gè)及以上腫瘤，即判定該小鼠發(fā)生結(jié)直腸癌。正常對(duì)照組和單純油菜籽組均未發(fā)生腫瘤；腫瘤模型組結(jié)直腸癌發(fā)生率90%（18/20），低劑量預(yù)防組發(fā)生率為45%，高劑量預(yù)防組發(fā)生率45%（9/20），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腫瘤模型組小鼠平均腫瘤數(shù)與低劑量預(yù)防組、高劑量預(yù)防組平均腫瘤數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠腫瘤發(fā)生率和平均腫瘤數(shù)目比較

2.5 病理組織學(xué)檢查

正常對(duì)照組和單純油菜籽組小鼠腸粘膜腺體排列規(guī)整，固有層炎癥細(xì)胞少見。實(shí)驗(yàn)中誘發(fā)的結(jié)直腸腫瘤多數(shù)為高分化管狀腺癌，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，大小不一，腺腔不規(guī)則，腺上皮異型增生明顯。

3 討論

動(dòng)物腫瘤模型是目前研究腫瘤預(yù)防常用的重要工具。結(jié)直腸癌常用的動(dòng)物模型是化學(xué)致癌，與人類結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程非常相似，其中研究最成熟和最為常用的是氧化偶氮甲烷聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉建立小鼠結(jié)直腸癌動(dòng)物模型（azoxymethane，AOM）[10]。AOM是DMH的代謝中間產(chǎn)物，具有比DMH更強(qiáng)的致癌性和化學(xué)穩(wěn)定性，已經(jīng)成為經(jīng)典的致癌劑。它是一種強(qiáng)氧化劑，通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜以及DNA過(guò)氧化損傷，誘發(fā)結(jié)直腸粘膜上皮細(xì)胞癌變[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)以AOM誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌模型，飲食中給予不同劑量的油菜籽進(jìn)行干預(yù)，觀察油菜籽對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生的預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AOM模型組小鼠腫瘤發(fā)生率為90%，與AOM模型組相比，低劑量預(yù)防組小鼠腫瘤發(fā)生率降低30%，高劑量預(yù)防組小鼠腫瘤發(fā)生率降低45%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，低劑量預(yù)防組和高劑量預(yù)防組每只小鼠平均帶瘤數(shù)較腫瘤模型組減少（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在食物中添加油菜籽可以預(yù)防AOM誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌，隨著油菜籽濃度的增加，其預(yù)防作用增強(qiáng)。

本研究證實(shí)，油菜籽對(duì)結(jié)直腸癌具有一定的預(yù)防作用，其確切的作用機(jī)制還不清楚，目前國(guó)內(nèi)外還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。油菜籽在我國(guó)產(chǎn)量很大，主要用于生產(chǎn)菜籽油。本課題組正在對(duì)油菜籽進(jìn)行活性成分提取，下一步深入研究它抗癌防癌的作用機(jī)制，為其未來(lái)應(yīng)用于腫瘤的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。