王海平 張素平 闕敢波 張奕平 劉全芳 張洪彬

靜脈血栓（venous thromboembolism，VTE）是臨床常見的一種疾病[1]，現(xiàn)有流行性學(xué)數(shù)據(jù)顯示亞洲地區(qū)VTE的病發(fā)率在14～57/1 000 000人/年[2-6]。人體抗凝系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)共同維持機(jī)體出血和缺血之間的平衡。其中，抗凝血酶（antithrombin，AT）作為是抗凝系統(tǒng)重要的組成成員，是超大家族蛋白質(zhì)酶抑制劑-絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，Serpins）的一種。AT通過中和凝血途徑中的凝血酶、因子（F）Ⅹa、FⅨa、FⅪa、FⅫa等發(fā)揮抗凝作用[7]，有研究顯示，SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)基因突變?cè)黾由铎o脈血栓風(fēng)險(xiǎn)（OR 1.29，95%Cl 1.10～1.49）[8]，但中國(guó)人群少見報(bào)道，尤其是針對(duì)家族體系?，F(xiàn)我們報(bào)道福建龍巖地區(qū)一個(gè)家族四代SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)基因突變與VTE的研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 家系基礎(chǔ)資料

先證者，女，漢族，48歲，BMI：21.48 kg/m2，無高血壓、糖尿病、高血脂、貧血，無傳染病、過敏史，無抽煙、飲酒，肝腎功能正常，已婚（育有一女一子，均健康）。主訴月經(jīng)淋漓不盡25天，入院陰道彩超診斷子宮肌瘤（6.5 cm×7.4 cm），2017年6月26日行“經(jīng)腹全子宮加雙側(cè)輸卵管切除術(shù)”，術(shù)前用藥頭孢唑啉，術(shù)后鈉鉀鎂鈣注射液500 mL、5%葡萄糖注射液500 mL+維生素C注射液2.0 g+維生素B6注射液0.2 g、復(fù)方氨基酸注射液250 mL、5%葡萄糖氯化鈉注射液500 mL補(bǔ)液，術(shù)后第4天患者訴右下肢小腿處腫脹，多普勒超聲診斷為“右下肢深靜脈血栓形成”（見圖1），當(dāng)日抗凝藥師會(huì)診醫(yī)囑穿彈力襪，口服華法林鈉鈉片2.5 mg，每晚一次，口服+達(dá)肝素鈉注射液5 000 IU皮下注射q12h橋接，2017年7月4日：INR：1.31，調(diào)整華法林劑量為3.125 mg，每晚一次，口服。2017年7月10日：INR：1.65，調(diào)整華法林鈉片劑量為3.75 mg，每晚一次，口服。2017年7月17日，復(fù)查INR：2.22，多普勒超聲復(fù)查診斷“右下肢深靜脈血栓形成”（見圖2），維持華法林鈉片3.75 mg，每晚一次，口服，停用達(dá)肝素鈉注射液，患者出院，門診隨訪治療。

圖1 先證者2017年6月30日術(shù)后第四天多普勒彩超圖（下肢深靜脈）

圖2 先證者2017年7月17日多普勒彩超圖（右下肢深靜脈）

抗凝門診治療情況如下：2017年7月24日：INR：2.48（華法林3.75 mg，每晚一次，口服）。2017年8月8日：INR：2.01（華法林3.75 mg，每晚一次，口服）。2017年8月24日：抗凝門診復(fù)查INR：2.19（華法林3.75 mg，每晚一次，口服），患者主訴右小腿偶有腫脹感，多普勒超聲復(fù)查診斷“雙下肢無深靜脈血栓形成”（見圖3）。2017年9月26日，INR：2.69（華法林3.75 mg，每晚1次，口服），患者訴右小腿無腫脹不適感。2017年10月31日，INR：2.21（華法林3.75 mg，每晚一次，口服）。2017年12月4日，INR：2.21（華法林3.75 mg，每晚1次，口服）。2018年1月5日，INR：2.01，患者抗凝治療療程已足，停止抗凝治療停用華法林。

圖3 先證者2017年8月24日多普勒彩超圖（雙下肢深靜脈）

先證者的哥哥：BMI：22.37 kg/m2，平素體健，無抽煙、飲酒等嗜好，20年前無外傷、手術(shù)等誘因發(fā)生右下肢深靜脈血栓，18年前再次無誘因發(fā)生腸系膜血栓，17年前無誘因發(fā)生肺栓塞經(jīng)搶救無效死亡。

先證者的舅舅：BMI：24.31 kg/m2，平素體健，無高血壓、糖尿病、高血脂、貧血，肝腎功能正常，偶有飲酒，無抽煙等不良嗜好，無誘因反復(fù)右下肢深靜脈血栓史（2006年12月診斷為右下肢深靜脈血栓，華法林抗凝治療半年腫脹消退；2009年3月再次診斷為右下肢深靜脈血栓，華法林抗凝治療后腫脹消退；2013年11月第三次診斷為右下肢深靜脈血栓），2017年5月18日因右下肢靠近腳踝處潰瘍就診我院門診，門診診斷：右下肢腳踝潰瘍，右下肢深靜脈血栓形成后遺癥。多普勒彩超顯示“右側(cè)髂靜脈及右下肢靜脈深靜脈陳舊性血栓栓塞” （見圖4），目前華法林鈉片3.75 mg每晚一次，口服抗凝治療。

圖4 先證者舅舅2017年5月18日多普勒彩超圖（右下肢深靜脈）

圖6 先證者INR監(jiān)測(cè)統(tǒng)計(jì)圖

圖5 遺傳性AT缺陷癥家系圖

先證者的表弟：BMI：21.51 kg/m2，平素體健，無高血壓、糖尿病、高血脂、貧血，肝腎功能正常，無抽煙、飲酒等不良嗜好，無誘因反復(fù)兩次右下肢深靜脈血栓史（2004年5月右下肢深靜脈血栓，經(jīng)華法林抗凝治療1年；2011年右下肢深靜脈血栓形成），長(zhǎng)期華法林抗凝5 mg，每晚1次。遺傳性AT缺陷癥家系圖，如圖5。

本研究?jī)?nèi)容獲院內(nèi)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有家族成員均簽署知情同意書。

1.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

收集18位家族成員外周血進(jìn)行生化分析，包括血液細(xì)胞分析（日本Sysmex2100型血球儀）；肝功能8項(xiàng)（羅氏原裝肝功能8項(xiàng)檢測(cè)試劑盒，羅氏c501全自動(dòng)生化儀）、腎功能5項(xiàng)（羅氏原裝腎功能5項(xiàng)檢測(cè)試劑盒，羅氏c501全自動(dòng)生化儀）；凝血四項(xiàng)與D-D二聚體檢測(cè)（檢測(cè)方法：凝固法，上海博研試劑盒，美國(guó)貝克曼公司型號(hào)為ACL TOP 700全自動(dòng)血凝儀）；蛋白C活性、蛋白S活性、AT活性（檢測(cè)方法：發(fā)色底物法，上海博研蛋白C檢測(cè)試劑盒，上海博研蛋白S檢測(cè)試劑盒，上海博研AT-Ⅲ檢測(cè)試劑盒，美國(guó)貝克曼公司ACL TOP700全自動(dòng)血凝儀）。

1.3 SERPINC1 rs2227589基因突變檢測(cè)

收集18位家族成員外周血進(jìn)行SERPINC1全基因測(cè)序。PCR 反 應(yīng) 體 系 10 μL：Premix prime STAR 5 μL，ddH2O 3 μL，引物工作液 1 μL，樣品DNA 1 μL，PCR過程：95℃ 3 min，95℃ 30 s、68℃ 15 s、72℃ 60 s，20 cycles，95℃ 30 s、58℃ 15 s、72℃ 60 s，16 cycles，72℃ 10 min，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、割膠后，用瓊脂糖DNA純化試劑盒（上海申能博彩公司）回收并純化，末端標(biāo)記雙脫氧法進(jìn)行正向和/或反向測(cè)序，使用Chromas軟件將SERPINC1測(cè)序結(jié)果與Genbank序列X68793. 1作比對(duì)分析，對(duì)所發(fā)現(xiàn)的基因突變，重新PCR擴(kuò)增相應(yīng)的片段，反向測(cè)序證實(shí)。

2 結(jié)果

2.1 先證者抗凝治療監(jiān)測(cè)

先證者因經(jīng)腹全子宮加雙側(cè)輸卵管切除術(shù)后深靜脈血栓，口服華法林抗凝治療半年，服藥期間患者依從性好，INR持續(xù)控制在2.0～3.0（見圖6）。

2.2 家族成員生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

生化指標(biāo)顯示，包括先證者在內(nèi)的多數(shù)家族成員APTT、PT、Fg、TT、蛋白酶C、S活性均正常。其中，先證者、先證者的母親（Ⅱ-1）、弟弟（Ⅲ-5）、表弟（Ⅲ-2）、表弟的女兒（Ⅳ-2）、兒子（Ⅳ-4）的抗凝血酶活性AT：A（%）略有下降；舅舅（血栓患者Ⅱ-3）和表弟（血栓患者Ⅲ-1）抗凝血酶活性AT：A（%）下降明顯，詳見（表1）。

表1 遺傳性缺陷 AT 家系先證者及家系成員生化檢測(cè)

2.3 家族成員SERPINC1 rs2227589基因突變檢測(cè)結(jié)果

SERPINC1基因檢測(cè)經(jīng)正反測(cè)序證實(shí)，采用Chromas軟件分析： 家族18名成員中有8位成員在rs2227589位點(diǎn)存在基因突變：?先證者、先證者的母親（Ⅱ-1）、舅舅（血栓患者Ⅱ-3）、弟弟（Ⅲ-5）、表弟（血栓患者Ⅲ-1）、表弟（Ⅲ-2）、表弟的女兒（Ⅳ-2）、兒子（Ⅳ-4）（rs2227589位點(diǎn)存在基因雜合突變），見圖7。

圖7 SERPINC1 rs2227589基因突變檢測(cè)

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外研究逐步開始關(guān)注SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)突變與AT活性及不良事件的相關(guān)性。Antón AI等[9]研究298例高加索健康人群中SERPINC1 rs2227589基因突變情況，發(fā)現(xiàn)A等位基因攜帶者相較于GG基因型人群具有較低的抗凝活性（97.0±7.3%vs.94.6±8.4%；P=0.032；99.5±5.8%vs. 94.8±5.6%；p=0.001）。Guerra-Shinohara EM等[10]納入117例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性與265例健康女性研究顯示SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)突變，增加女性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)（OR：1.77，95%CI：1.05～3.00，P=0.034）。王強(qiáng)等[11]在骨科關(guān)節(jié)置換、植入物置入等較大創(chuàng)傷型手術(shù)后靜脈血栓前狀態(tài)的基因預(yù)測(cè)診斷的論述中強(qiáng)調(diào)骨科術(shù)后VTE的發(fā)生需要關(guān)注遺傳方面的致病基因，早預(yù)防，早治療。孫玉發(fā)等[12]在老年人群冠心病易感基因的研究中，納入246例冠心病患者于185例健康人群對(duì)比，發(fā)現(xiàn)攜帶SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)突變基因的個(gè)體相較于野生型，冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=1.79，CI：1.22～2.63，P=0.003）。SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)基因突變將影響AT活性，進(jìn)而影響機(jī)體抗凝系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，增加血栓風(fēng)險(xiǎn)，在有血栓家族史的人群中將會(huì)表現(xiàn)的更為明顯。

本研究報(bào)道了一例家族四代SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)基因突變與VTE的研究。家族成員中有7位SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)存在突變，且除了先證者以外，確診的反復(fù)VTE成員（Ⅱ-1、Ⅲ-1）均是SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)突變攜帶者，考慮SERPINC1 rs2227589位點(diǎn)是該家族血栓高發(fā)的易感因素。介于本研究家族體系人數(shù)的限制，后續(xù)擬將擴(kuò)大人群樣本，在中國(guó)人群中對(duì)SERPINC1 rs2227589基因多態(tài)性與VTE發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行研究，可能將為VTE的預(yù)防和治療做一提示。