李永麗，閆作炳，周洲，張永安，曲良建

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091)

利尿激肽Helicokinin I(YFSPWG-NH2)是從美洲棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa zea(Boddie)大腦中分離提取的一種小分子昆蟲(chóng)神經(jīng)肽，屬昆蟲(chóng)激肽(Insect kinins)家族的一員。Seinsche 等證實(shí)將利尿激肽Helicokinin I 作用于煙芽夜蛾Heliothis virescens幼蟲(chóng)能顯著抑制其體重增加，并發(fā)現(xiàn)糞便中水分排泄的增加，以及在幼蟲(chóng)中誘導(dǎo)出饑餓信號(hào)，導(dǎo)致能量?jī)?chǔ)存和營(yíng)養(yǎng)消化效率的降低[1]。已有研究證實(shí)極微量的利尿激肽 Helicokinin I 或其類(lèi)似物注入昆蟲(chóng)體內(nèi)，可顯著增加其體內(nèi)液體排泄，并誘導(dǎo)饑餓反應(yīng)、消化酶釋放抑制等生理代謝變化，導(dǎo)致試蟲(chóng)的體重減輕甚至死亡[1-3]。昆蟲(chóng)神經(jīng)肽來(lái)源于生物體，具有對(duì)高等生物和環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具應(yīng)用潛力的天然殺蟲(chóng)活性物質(zhì)，對(duì)其開(kāi)展應(yīng)用技術(shù)的研究可為害蟲(chóng)治理提供思路。

利尿激肽Helicokinin I 作為一種短肽類(lèi)殺蟲(chóng)物質(zhì)用于害蟲(chóng)治理時(shí)，首先要保證其在環(huán)境中的穩(wěn)定性，其次還要滿足該物質(zhì)能夠穿透昆蟲(chóng)體壁或者通過(guò)消化道順利進(jìn)入蟲(chóng)體進(jìn)而發(fā)揮作用，這是目前昆蟲(chóng)神經(jīng)肽在害蟲(chóng)治理應(yīng)用中亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。利尿激肽Helicokinin I 直接穿過(guò)昆蟲(chóng)體壁角質(zhì)而進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)難度較大，通過(guò)昆蟲(chóng)的取食行為使該神經(jīng)肽經(jīng)消化道進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)揮活性是一種更可行的方法，但如何有效解決昆蟲(chóng)消化道酶對(duì)外源神經(jīng)肽的降解是其應(yīng)用中必須要解決的問(wèn)題。

穿膜肽 TAT (transactivator of transcription，TAT)為HIV 病毒有效轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必須的多肽序列[4]，TAT 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能將與之共價(jià)連接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白質(zhì)等)非特異地轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部，這種過(guò)程既不依賴(lài)于受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也與溫度和能量無(wú)關(guān)，而且對(duì)宿主細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性[5-8]。已有研究表明，細(xì)胞穿膜肽TAT 能夠攜帶與之融合的昆蟲(chóng)神經(jīng)肽滯育激素(diapause hormone，DH)經(jīng)舞毒蛾Lymantria dispar(Linnaeus)幼蟲(chóng)取食途徑實(shí)現(xiàn)融合蛋白TAT-DH 在幼蟲(chóng)體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)到達(dá)其他組織，且該過(guò)程與融合蛋白的攝入量成比例[9]。為探明Helicokinin I 對(duì)舞毒蛾的活性與應(yīng)用潛力，在完成TAT-Helicokinin I 融合肽合成與分析的基礎(chǔ)上，筆者于2016年7—8月在河南科技大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試了利尿激肽Helicokinin I 和融合肽TAT-Helicokinin I 對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)注射活性，比較二者經(jīng)取食途徑進(jìn)入蟲(chóng)體后對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響，以期為今后深入研究利尿激肽Helicokinin I 在害蟲(chóng)治理中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 C 末端乙醛化的3 種多肽TAT、Helicokinin I 和 TAT-Helicokinin I 由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)純化后純度達(dá)99%，氨基酸序列經(jīng)質(zhì)譜法(mass spectrometry)分析正確；TAT 多肽氨基酸編碼序列為YGRKKRRQRRR，Helicokinin I 多肽氨基酸編碼序列為YFSPWG，TAT-Helicokinin I 多肽氨基酸編碼序列為YGRKKRRQRRRYFSPWG；舞毒蛾幼蟲(chóng)及其人工飼料由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所昆蟲(chóng)病原微生物研究室提供。

1.2 3 種多肽對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)注射活性測(cè)試 將TAT、Helicokinin I 和 TAT-Helicokinin I 多肽干粉分別溶于無(wú)菌超純水中，每種多肽設(shè)置1.5，15，150 μmol/L 3 個(gè)濃度，多肽溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。2016年7月，挑選生長(zhǎng)一致的舞毒蛾3 齡末期幼蟲(chóng)，用微量注射器分別將配置好的多肽溶液緩慢注入幼蟲(chóng)體內(nèi)。每頭幼蟲(chóng)注射4 μL 多肽溶液，即每種多肽注射幼蟲(chóng)分別達(dá)到 6，60，600 pmol /頭；對(duì)照組(CK)注射4 μL 無(wú)菌水。每個(gè)濃度處理試蟲(chóng)20 頭，每個(gè)處理重復(fù)3 次。注射方法參照 Seinsche 等[1]略加改動(dòng)，將4 μL 多肽水溶液或無(wú)菌水從蟲(chóng)體背面距尾部第3 至第4 對(duì)毛瘤之間緩慢注入。注射后將試蟲(chóng)放置于人工飼料上自由取食，試蟲(chóng)于培養(yǎng)箱中單頭飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度設(shè)置26 ℃；每隔24 h 稱(chēng)量試蟲(chóng)體質(zhì)量，并記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)。

1.3 2 種多肽對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)飼喂活性測(cè)試 將Helicokinin I 和 TAT-Helicokinin I 多肽干粉分別溶解于無(wú)菌超純水中，分別將其配置成20，60 μmol/L 2種濃度，多肽溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。2016年8月，吸取200 μL的多肽水溶液滴加在每瓶飼料表面，用涂布器涂抹均勻后自然晾干5 min 后備用；對(duì)照組(CK)每瓶飼料表面涂抹200 μL 無(wú)菌水，自然晾干5 min后備用。每瓶飼料放入1 頭試蟲(chóng)，自由取食，試驗(yàn)共5 個(gè)組，每個(gè)處理20 頭幼蟲(chóng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次；每隔24 h 稱(chēng)量試蟲(chóng)體質(zhì)量，并記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種多肽對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)的注射活性 在注射無(wú)菌水后對(duì)照組試蟲(chóng)繼續(xù)正常生長(zhǎng)，注射TAT 后試蟲(chóng)生長(zhǎng)亦不受影響，注射TAT-Helicokinin I 和Helicokinin I 對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)均表現(xiàn)出注射毒性，且TATHelicokinin I 比Helicokinin I 表現(xiàn)出更高的生物活性。60，600 pmol/頭劑量的 TAT-Helicokinin I 和Helicokinin I 對(duì)試蟲(chóng)均表現(xiàn)出致死性，試蟲(chóng)死亡發(fā)生在注射48 h 內(nèi)，超過(guò)48 h 后死蟲(chóng)數(shù)量增加不明顯，6 pmol/頭的低劑量對(duì)試蟲(chóng)生長(zhǎng)沒(méi)有影響；注射600 pmol/頭的融合肽TAT-Helicokinin I 后，舞毒蛾幼蟲(chóng) 24，48，72 h 的校正死亡率分別為 36.8%，57.9%，57.9%，而注射600 pmol/頭的Helicokinin I肽后，舞毒蛾幼蟲(chóng)24，48，72 h 的校正死亡率分別僅為10.5%，15.8%，21.1%，其生物活性顯著低于融合肽TAT-Helicokinin I(表1)。

2.2 2 種多肽對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)的取食活性 飼喂Helicokinin I濃度為 20，60 μmol/L 的處理組舞毒蛾幼蟲(chóng)與對(duì)照組在體質(zhì)量增長(zhǎng)上無(wú)顯著差異，而飼喂TAT-Helicokinin I 的處理組舞毒蛾幼蟲(chóng)體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯低于對(duì)照組。當(dāng) TAT-Helicokinin I 濃度為60 μmol/L時(shí)，對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著抑制作用，取食2 d后幼蟲(chóng)平均體質(zhì)量為100.2 mg，顯著低于對(duì)照組取食2 d 后平均體質(zhì)量115.3 mg(圖1)。

表1 3 種多肽不同劑量注射舞毒蛾幼蟲(chóng)的死亡率

圖1 2 種多肽不同濃度飼喂對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響

3 討論

已有研究表明，穿膜肽TAT 對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性[5-6]，本研究中注射TAT 對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)沒(méi)有毒性，進(jìn)一步驗(yàn)證和證實(shí)了該結(jié)論。注射TAT-Helicokinin I 和Helicokinin I 則對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)均表現(xiàn)出活性，且TAT-Helicokinin I 的生物活性更高，其原因可能源于TAT 高效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加了融合肽TAT-Helicokinin I 的穩(wěn)定性，從而對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較高的致死效應(yīng)。Seinsche 等[1]在煙芽夜蛾的研究中發(fā)現(xiàn)，幼蟲(chóng)體內(nèi)注射50 pmol 的Helicokinin I 可表現(xiàn)出致死性，本研究中筆者亦發(fā)現(xiàn)該多肽60 pmol/頭的劑量可對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)表現(xiàn)出致死性，但6 pmol/頭的劑量對(duì)試蟲(chóng)生長(zhǎng)無(wú)影響。

利用幼蟲(chóng)注射的方法雖然能夠證實(shí)利尿激肽Helicokinin I 對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的生物活性，但該方法難以在害蟲(chóng)治理中應(yīng)用。若能利用害蟲(chóng)的取食行為，使外源融合肽TAT-Helicokinin I 經(jīng)消化道跨膜運(yùn)輸進(jìn)入蟲(chóng)體而發(fā)揮生物活性，則不失為一種更可取的方法。本研究中的喂食試驗(yàn)顯示，融合肽TAT-Helicokinin I 對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)體質(zhì)量增長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制作用，而Helicokinin I 則不具有類(lèi)似活性，進(jìn)一步證明了融合肽TAT-Helicokinin I 的高效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用和穩(wěn)定性。試驗(yàn)中飼喂?jié)舛葹?0 μmol/L 的融合肽TAT-Helicokinin I 時(shí)，并未造成試蟲(chóng)死亡，其原因一方面可能是飼喂TAT-Helicokinin I 的量還比較低，另一方面也可能是因?yàn)門(mén)AT 與Helicokinin I 融合后仍存在部分被消化道酶降解的可能。因此，研發(fā)更加高效的細(xì)胞穿膜肽，或者在融合肽TAT-Helicokinin I 基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究增加抑制消化酶的高效基因，將對(duì)促進(jìn)利尿激肽在害蟲(chóng)治理中的應(yīng)用具有重要作用。此外，嘗試通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，闡明融合肽TAT-Helicokinin I 在植物中的表達(dá)量和生物活性亦對(duì)該神經(jīng)肽的應(yīng)用具有積極意義。

本文作者對(duì)利尿激肽Helicokinin I 的生物活性進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)其與細(xì)胞穿膜肽TAT 有效融合后經(jīng)昆蟲(chóng)取食途徑應(yīng)用于害蟲(chóng)防治的設(shè)想進(jìn)行了初步探索，研究結(jié)果可為今后Helicokinin I 在害蟲(chóng)治理中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)參考，為其他昆蟲(chóng)小分子神經(jīng)肽的在害蟲(chóng)治理中的應(yīng)用研究提供借鑒和思考；研究中設(shè)計(jì)的氨基酸序列亦可為今后新型殺蟲(chóng)基因研究和應(yīng)用提供依據(jù)。