于海英，吳昊，張旭東，王立明，張歆逢，宋玉雙

(1.國家林業(yè)局森林病蟲害防治總站，林業(yè)有害生物監(jiān)測預(yù)警國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧省林業(yè)有害生物防治檢疫局，遼寧 沈陽 110084；3 新賓縣林業(yè)局監(jiān)測中心，遼寧 新賓 113200 )

落葉松屬Larixspp.植物產(chǎn)于北半球高山及高寒地帶，廣泛分布于我國東北、華北、西北等地區(qū)[1]，是我國北方地區(qū)重要的用材和生態(tài)樹種[2]。松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus在我國危害馬尾松Pinus massoniana、油松P.tabulaeformis、赤松P.densiflora、華山松P.armandii、黑松P.thunbergii等多種松科松屬樹種[3-5]，是一種危險(xiǎn)性極高的外來有害生物。近年來，松材線蟲在向北擴(kuò)散蔓延的過程中不斷危害紅松P.koraiensis等新寄主[6]，國外資料曾記載可危害落葉松[7]，但我國未曾發(fā)現(xiàn)自然條件下感染落葉松的案例。2018年秋季遼寧省撫順市出現(xiàn)長白落葉松Larix olgensis、日本落葉松L.kaempferi和華北落葉松L.principis-rupprechtii大面積枯死現(xiàn)象，筆者對該地區(qū)落葉松異?？菟狼闆r進(jìn)行調(diào)查及病原線蟲檢測，明確了松材線蟲在我國北方自然條件下能夠自然感染落葉松，為東北地區(qū)松屬以外的松科樹種的松材線蟲病預(yù)防和除治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況及取樣 2018年8月30日至9月6日，對遼寧省撫順市2 個(gè)樣地共78 株枯死樹取樣。

新賓縣南雜木鎮(zhèn)南雜木村6 林班52 小班，海拔216 m，面積0.7 hm2，樹種為日本落葉松，林齡45 a，取24 株枯死樹病樣。

清原縣紅透山鎮(zhèn)北雜木村32 林班15 小班，海拔150 m，面積2.8 hm2，日本落葉松、長白落葉松和華北落葉松比例為 5∶4∶1。平均林齡 42 a。取日本落葉松枯死樹26 株、長白落葉松枯死樹23 株、華北落葉松枯死樹5 株，共54 株枯死樹病樣。

1.2 病樹取樣 離地1.2 m 處采集5 cm 厚的圓盤；用砍刀將樹皮削掉，砍取木質(zhì)部碎片，深度超過1 cm；用電鉆(≥1 cm 直徑麻花鉆頭)鉆取木質(zhì)部5 cm深木顆粒，裝入標(biāo)本袋。共采集樣本78 份，用于分離鑒定病原線蟲。

1.3 線蟲分離 采用貝爾曼漏斗法進(jìn)行線蟲分離。將采集木樣劈成火柴棍大小，2 層紙巾包好，純凈水浸泡24 h 后漏取2 mL 左右線蟲懸浮液放入離心管中，3 000 r / min 離心5 min 后，吸取管底線蟲液用于形態(tài)鑒定和分子鑒定。

1.4 形態(tài)鑒定 用100 μL 移液槍吸取離心管底部線蟲懸浮液滴至載玻片，在體視解剖鏡下用10 μL移液槍分別挑取線蟲雌、雄成蟲不少于1 頭，將其置于酒精燈火焰上方加熱3～5 s，線蟲熱殺死后加蓋玻片，制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察線蟲形態(tài)特征并進(jìn)行形態(tài)鑒定。未見線蟲成蟲蟲態(tài)的用10 μL 移液槍挑取線蟲幼蟲100 頭接種到灰葡萄孢菌Botrytis cinerea培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 5～10 d，待灰葡萄孢菌絲取食完畢，用蒸餾水將線蟲洗出獲得線蟲成蟲；部分木樣充分吸水后于30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h[8]，重復(fù)1.3 步驟分離直接獲得線蟲成蟲。

1.5 分子鑒定 用100 μL 的移液槍吸取1.3 分離后的離心管底部線蟲懸浮液，放入載玻片凹片里，低倍顯微鏡觀察是否有線蟲，用移液槍在低倍顯微鏡(4 ×物鏡)下吸取20 μL 線蟲懸浮液(確保用于分子鑒定的液體中至少含一條線蟲)置于200 μL PCR管中，按照松材線蟲檢測試劑盒(南京生興生物技術(shù)有限公司提供)要求的步驟提取線蟲DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增和檢測[9]。20 μL 線蟲懸浮液中加入線蟲裂解液(A 液)20 μL，蛋白酶K 液(B 液)2 μL，置于金屬浴中于 68 ℃ 條件下保溫處理40 min，于95 ℃下保溫處理10 min；12 000 r/min離心3 min，上清液(模板DNA)用于擴(kuò)增 。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系共10 μL，包括 TaqMan 通用 PCR 預(yù)混液 (TaqMan Universal PCR Master Mix) 5 μL，10 μmol/L TaqMan 探針0.5 μL，10 μmol/L 正向引物與反向引物各 0.5 μL，模板 DNA 3.5 μL。正向引物序列為 5′-GAGCAGAAACGCCGACTT-3′，反向引物序列為 5′-CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3′，TaqMan探針序列為5′-TGCACGTTGTGACAGTCGT-3′，探針5′端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)為6-carboxyfluorescein(FAM)，3′端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)為 tetramethyl-carboxy-rhodamine(TAMRA)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)樗刹木€蟲自動化快速檢測儀(南京生興生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))自動檢測程序，即95 ℃運(yùn)行10 min，進(jìn)入循環(huán)程序:95 ℃下運(yùn)行15 s，60 ℃下運(yùn)行35 s，共35 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 落葉松異常枯死情況 共調(diào)查枯死落葉松78株，經(jīng)檢視，均有小蠹蟲危害，未發(fā)現(xiàn)天牛產(chǎn)卵刻槽及侵入孔，木質(zhì)部未發(fā)現(xiàn)天牛及其他蛀干害蟲蛀道。78 株枯死樹中有11 株分離出松材線蟲，28 株無線蟲，其余木樣含滑刃屬、傘滑刃屬等寄生線蟲及部分腐生線蟲，未發(fā)現(xiàn)擬松材線蟲(表1)。松材線蟲感染率為14%。

11 株含松材線蟲的落葉松中有7 株日本落葉松、3 株長白落葉松、1 株華北落葉松。受松材線蟲感染的落葉松半枯狀態(tài)的中下部針葉退綠變黃，全枯狀態(tài)落葉松為黃褐色，并伴隨針葉脫落現(xiàn)象。

落葉松林中枯死樹多分布于林緣地帶，或與原感病紅松林、油松林(已伐除)相接區(qū)域的落葉松枯死現(xiàn)象嚴(yán)重。

表1 枯死落葉松上病原線蟲分離情況

2.2 線蟲鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)觀察結(jié)果 雌線蟲熱殺死后蟲體略向腹面彎曲，蟲體纖細(xì)，長約1 mm，頭體交界處縮益明顯；有口針，口針基部有小的膨大；中食道球卵圓形，占體寬的3/4 左右，瓣門清晰；陰門位于蟲體中后部，陰門蓋明顯；部分雌蟲尾部呈指狀，末端鈍圓，部分雌蟲尾部有尾尖突。雄蟲熱殺死后蟲體呈“J”形，蟲體前部與雌蟲相似；交合刺呈弓形，成對，基頂和喙突顯著，喙突銳尖，內(nèi)緣和外緣末端有盤狀突；尾端尖細(xì)，側(cè)觀呈爪狀，尾腹面觀可見卵圓形交合傘。(圖1)。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，確定為松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus。并對松材線蟲形態(tài)進(jìn)行測量(表2)。

圖1 分離自遼寧撫順地區(qū)落葉松松材線蟲形態(tài)特征

表2 枯死落葉松上分離的松材線蟲形態(tài)測量值

2.2.2 分子鑒定結(jié)果 從感病落葉松上分離疑似松材線蟲，以其DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，熒光信號由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長階段的循環(huán)次數(shù)，即Ct值在19～28 之間。經(jīng)快速檢測儀檢測鑒定，結(jié)合落葉松的發(fā)病特征和線蟲形態(tài)特征，確定落葉松中分離的部分病原線蟲為松材線蟲。

3 結(jié)論與討論

通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定明確了松材線蟲在我國北方自然條件下能夠自然感染落葉松。落葉松是我國東北、內(nèi)蒙古林區(qū)以及華北、西南的高山針葉林主要組成樹種，是東北地區(qū)主要三大針葉用材林樹種之一。落葉松因其是針葉樹種中最耐寒的樹種，在東北地區(qū)廣泛種植，占人工林總面積的70%[10-11]，且多為落葉松純林，一旦大面積感染松材線蟲，將會造成無法彌補(bǔ)的巨大損失。

取樣的枯死落葉松中松材線蟲檢出率為14%，其余落葉松枯死原因有待進(jìn)一步研究。落葉松枯死樹多分布于林緣地帶或與原感染松材線蟲的紅松林、油松林接壤處，因紅松、油松已清理，可能因媒介昆蟲云杉花墨天牛Monochamus saltuariusGebler 缺乏食物而取食落葉松，造成落葉松感染。此外，落葉松中分離的松材線蟲與從油松、紅松中分離的松材線蟲形態(tài)對比，個(gè)體略小，線蟲數(shù)量少，其原因還需深入研究。

目前，落葉松上除小蠹蟲危害較重外，未發(fā)現(xiàn)落葉松木質(zhì)部中的天牛蛀道和其他蛀干害蟲蛀道。據(jù)記載，落葉松八齒小蠹Ips subelongatusMotschulsky、云杉大黑天牛Monochamus urussoviFisher、云杉小黑天牛Monochamus sutorLinnaeus、白帶長角天牛Acanthocinus carinulatusGebler 等蛀干害蟲在樹勢衰弱時(shí)可迅速侵入落葉松[12]。這些蛀干害蟲一旦侵入落葉松能否成為松材線蟲的傳播媒介、完成侵染循環(huán)，有待于進(jìn)一步研究。落葉松感染松材線蟲的癥狀表現(xiàn)及發(fā)生規(guī)律等有別于在松屬植物上的典型癥狀和一般規(guī)律，也有待進(jìn)一步觀察。松材線蟲的媒介昆蟲及寄主樹種多且雜，應(yīng)加強(qiáng)對疫區(qū)落葉松林病死樹的疫情監(jiān)測，定期開展專項(xiàng)普查，及時(shí)開展除治。同時(shí)要加大非疫區(qū)落葉松林松材線蟲及其潛在媒介昆蟲的監(jiān)測預(yù)警力度。

國外報(bào)道非松屬的云杉屬Picea9 種、冷杉屬Abies7 種、雪松屬Cedrus2 種樹種均是松材線蟲的自然感病寄主和人工接種感病寄主[3]，我國目前雖未發(fā)現(xiàn)，但不能排除松材線蟲在這些樹種上自然發(fā)生的可能性，故應(yīng)加強(qiáng)對所有松科植物的監(jiān)測。

致謝：寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局顧建鋒博士提供顯微攝影設(shè)備并對本文提出了重要修改意見，深表感謝!