董曉燕，董旭婷，孟 杰

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300354)

阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，主要病發(fā)于 65歲以上的老人，臨床上的主要表現(xiàn)為：短期內(nèi)出現(xiàn)記憶力下降、情緒波動(dòng)以及意識(shí)混亂等癥狀，伴隨時(shí)間病情愈發(fā)嚴(yán)重，最終會(huì)完全喪失自理能力，甚至導(dǎo)致死亡[1-2].目前，全球 AD患者數(shù)量正在迅速增長(zhǎng)，因此對(duì) AD的治療和預(yù)防意義重大[3].

患者腦內(nèi)出現(xiàn)淀粉樣斑塊(老年斑)是 AD最主要的病理學(xué)特征[4].淀粉樣蛋白容易錯(cuò)誤折疊形成富含β折疊的纖維狀沉淀，其中β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)是淀粉樣斑塊的主要組成部分.Aβ是淀粉樣前體蛋白的水解產(chǎn)物，一般由 38～43個(gè)氨基酸組成[5].其中最豐富的是Aβ40和 Aβ42[6]，神經(jīng)毒性的主要來(lái)源是 Aβ寡聚體和成熟的 Aβ纖維[7-8].所以，抑制Aβ聚集是治療AD的有效手段.

研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者腦內(nèi)的淀粉樣斑塊中還有較高濃度的金屬離子(Cu2+、Fe3+、Zn2+和 Al3+等)，并與 Aβ結(jié)合，加速 Aβ聚集[9]，加劇聚集體的神經(jīng)毒性，并產(chǎn)生更高的氧化壓力，從而進(jìn)一步加重患者的臨床癥狀[10].另外，Cu2+在體內(nèi)的平衡失調(diào)，會(huì)促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，增加氧化應(yīng)激，帶來(lái)更大的神經(jīng)毒性[11-12].因此，有研究者開(kāi)發(fā)了一些金屬螯合的Aβ聚集抑制劑.如：親脂螯合劑(DP109)已被證明能在老鼠模型中降低 Aβ聚集體并增加可溶性 Aβ[13]；在Tg2576模型小鼠中，使用氯碘羥喹(CQ)口服治療可減少淀粉樣蛋白的沉積[14].近年研究發(fā)現(xiàn)，有些三肽對(duì) Cu2+具有特異性的螯合作用，且不會(huì)影響體內(nèi)其他維持正常生理功能的重要金屬離子的作用，因此備受關(guān)注[15].研究表明，這些三肽具有以下特征：具有氨基末端的游離氮、第3位組氨酸側(cè)鏈的咪唑氮和第1、第3位氨基酸殘基之間的2個(gè)肽氮，這4個(gè)氮與銅在正方形平面構(gòu)型中可以得到配位[16].

另外，多肽作為 Aβ聚集抑制劑，相比于其他抑制劑具有許多優(yōu)勢(shì).如易于合成和修飾、具有良好的生物相容性和結(jié)合特異性等[17-18].Aβ的某些片段、例如 Aβ16-20(KLVFF)、Aβ17-21(LVFFA)、Aβ32-37(IGLMVG)和 Aβ37-42(GGVVIA)[19-22]等經(jīng)常被用作 Aβ聚集抑制劑的設(shè)計(jì)起點(diǎn)，因?yàn)樾蛄械耐葱裕@些片段能夠和全長(zhǎng)的 Aβ特異性結(jié)合.本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)在 LVFFA的 C-末端增加 2個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基R和K，得到七肽抑制劑LK7(LVFFARK).因?yàn)樵黾恿遂o電作用，所以 LK7更好地發(fā)揮了抑制Aβ聚集的效果[23].

由于金屬離子 Cu2+會(huì)對(duì) Aβ的聚集產(chǎn)生影響并與 AD的發(fā)病密切相關(guān)[24]，因此設(shè)計(jì)一種既可抑制Aβ聚集、又可結(jié)合金屬離子 Cu2+的雙功能抑制劑顯得尤為重要.基于 Mlynarz等[25]研究證明金屬螯合三肽(SSH)是一種有效且穩(wěn)定的 Cu2+螯合劑，本研究將 SSH和 LK7連接，形成十肽(SSHLVFFARKNH2)雙功能抑制劑 SK10.通過(guò)硫代黃素 T(ThT)熒光、原子力顯微鏡(AFM)和細(xì)胞毒性等實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了SK10對(duì) Cu2+存在下的 Aβ40聚集的抑制作用；以酪氨酸熒光和等溫滴定量熱法(ITC)證明了 SK10對(duì)Cu2+的親和力和特異性，并利用香豆素-3-羧酸(3-CCA)熒光實(shí)驗(yàn)分析了 SK10對(duì) ROS產(chǎn)生的抑制作用.最后考察了 SK10對(duì) Cu2+-Aβ40聚集體的解聚作用及其對(duì)細(xì)胞毒性的緩解作用.

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(HEPES)、ThT、二甲基亞砜(DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)和 3-CCA 均購(gòu)自 Sigma公司(圣路易斯，密蘇里州，美國(guó))；1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司(上海，中國(guó))；抗壞血酸從J＆K Scientific(北京，中國(guó))獲得；Aβ40(純度＞95%)購(gòu)自吉爾生化有限公司(上海，中國(guó))；SK10、LK7和SSH(純度＞95%)購(gòu)自紫域生物科技有限公司(中國(guó)上海)；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司(加利福尼亞州，美國(guó))；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海，中國(guó)).

實(shí)驗(yàn)儀器：冷凍干燥儀(Labconco FreeZone，Labconco，美國(guó))；熒光分光光度計(jì)(LS55，PerkinElmer，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Infinite M200，Tecan，瑞士)；原子力顯微鏡(CSPM5500，本原納米儀器有限公司，中國(guó))；等溫滴定量熱儀(VP-ITC，MicroCal，美國(guó)).

1.2 β-淀粉樣蛋白單體溶液的制備

Aβ單體的制備參見(jiàn)文獻(xiàn)[26]，將保存在-70℃的Aβ以1mg/mL的濃度溶解在HFIP中，超聲處理30min以破壞殘留的 Aβ聚集體，之后靜置 2h以便Aβ充分溶解.最后將溶液放在-70℃下冷凍干燥過(guò)夜. 然后將冷凍的樣品放在真空冷凍干燥儀中去除HFIP，得到 Aβ粉末在-20℃下保存?zhèn)溆?取適量處理好的蛋白，溶于 20mmol/L的 NaOH溶液，超聲10min，用 pH＝7.4的 hepes緩沖液配成適當(dāng)濃度的Aβ樣品.

1.3 ThT熒光實(shí)驗(yàn)

稱取適量Aβ溶于20mmol/L的NaOH溶液中，制成濃度為 275μmol/L的母液，將 Aβ(25μmol/L)與CuCl2(10μmol/L)和不同濃度的多肽抑制劑(即SSH、LK7和 SK10)在 37℃、150r/min的空氣搖床中共培養(yǎng) 72h后取樣檢測(cè).取適量樣品，用 ThT染液(25μmol/L ThT，20mmol/L hepes)稀釋 11倍后，通過(guò)熒光光譜儀測(cè)定ThT熒光強(qiáng)度.儀器參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng) 440nm，發(fā)射波長(zhǎng) 480nm，激發(fā)光譜/發(fā)射光譜帶寬5nm.將僅含Aβ樣品的熒光強(qiáng)度設(shè)為100%進(jìn)行歸一化處理.每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)至少重復(fù) 3次取平均值.

1.4 動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將 200μL 含有 25μmol/LAβ40單體、25μmol/L ThT、10μmol/L CuCl2和不同濃度的多肽抑制劑的樣品在96孔板中混合，并在 37℃下培養(yǎng).通過(guò)多功能酶標(biāo)儀 10min讀數(shù)間隔記錄每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度，440nm 激發(fā)波長(zhǎng)，480nm 發(fā)射波長(zhǎng)，并在每次測(cè)量之前振蕩 5s.使用 S形擬合方程[27]對(duì)聚集的動(dòng)力學(xué)增長(zhǎng)曲線進(jìn)行歸一化，即

式中：y為時(shí)間t的熒光強(qiáng)度；y0和ymax分別為最小和最大熒光強(qiáng)度；t1/2為熒光強(qiáng)度達(dá)到最大強(qiáng)度的 1/2時(shí)的時(shí)間；k為聚集速率常數(shù).根據(jù)擬合，可以計(jì)算滯后階段時(shí)間Tlag為

通過(guò)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分析多肽抑制劑對(duì) Cu2+存在下Aβ40聚集體的解聚作用.將含有25μmol/L Aβ40單體和10μmol/L CuCl2在37℃、150r/min間歇搖動(dòng)的空氣搖床中培養(yǎng) 72h 后，加入不同濃度的多肽抑制劑在 96孔板中混合，并在 37℃下培養(yǎng).通過(guò)酶標(biāo)儀記錄每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度.

1.5 原子力顯微鏡實(shí)驗(yàn)(AFM)

利用原子力顯微鏡觀察 Cu2+存在下 Aβ的形貌特征.原子力顯微鏡檢測(cè)樣品同 ThT熒光實(shí)驗(yàn)一致.將 50μL樣品滴在新鮮切割的云母底物上5min，用去離子水輕輕沖洗，空氣干燥過(guò)夜，使用CSPM5500原子力顯微鏡在輕敲模式下掃描，共振頻率為30kHz，調(diào)制強(qiáng)度為1.5V.每個(gè)樣品至少掃描4個(gè)不同的部位.

1.6 酪氨酸熒光檢測(cè)

酪氨酸熒光分析可以用來(lái)檢測(cè)Cu2+與Aβ40的結(jié)合程度以及多肽抑制劑對(duì)其抑制作用.Aβ40中 Tyr10具有熒光效應(yīng)，而 Cu2+與 Aβ40結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生熒光猝滅，抑制劑與 Aβ40結(jié)合的 Cu2+螯合后，Aβ40中 Tyr10恢復(fù)產(chǎn)生熒光.實(shí)驗(yàn)用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè).激發(fā)光波長(zhǎng) 274nm，發(fā)射光 299nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為 5nm.將含有 Aβ40(25μmol/L)、CuCl2(10μmol/L)和不同濃度的多肽抑制劑在37℃下培養(yǎng)20min后檢測(cè).

1.7 等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)(ITC)

等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)使用 VP-ITC在 37℃進(jìn)行.首先將 SK10溶解于 hepes緩沖液中，終濃度為0.5mmol/L.脫氣 15min后加入至 1.425mL的樣品池中.然后將甘氨酸和 CuCl2溶解于 hepes緩沖液中，終濃度 10mmol/L和 2.5mmol/L，置于滴定針中，兩個(gè)溶液都含有5%DMSO.每350s滴定1次，一共滴定 26次，樣品池轉(zhuǎn)速為 307r/min.作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將 hepes緩沖液加入到樣品池中，從而得到滴定過(guò)程中的稀釋熱.在結(jié)果分析時(shí)，把稀釋熱從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中減去.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值.

1.8 3-CCA熒光測(cè)定實(shí)驗(yàn)

3-CCA熒光實(shí)驗(yàn)用來(lái)監(jiān)測(cè)羥基自由基 HO·的生成速率，來(lái)評(píng)估 SK10螯合金屬離子 Cu2+的效果.Cu2+在還原劑抗壞血酸存在下被還原成 Cu+，Cu+催化生成HO·，香豆素-3-羧酸(3-CCA)能夠與HO·反應(yīng)生成具有熒光效應(yīng)的香豆素-7-羧酸(7-CCA)，因此通過(guò)檢測(cè)體系的熒光變化就可以反映 HO·的生成速率[28-29].將 10μmol/L Cu2+、25μmol/L Aβ40、不同濃度的多肽抑制劑、500μmol/3-CCA 和 500μmol/抗壞血酸混合后用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，熒光激發(fā)波長(zhǎng) 390nm，發(fā)射波長(zhǎng) 447nm.結(jié)果是 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值.

1.9 MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

使用SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行MTT測(cè)定以評(píng)估多肽對(duì)Aβ40細(xì)胞毒性的作用.將SH-SY5Y細(xì)胞在補(bǔ)充有15%FBS、100U/mL青霉素和 100U/mL鏈霉素的DMEM/F12中于 37℃、5%CO2下培養(yǎng).將 SHSY5Y 細(xì)胞(80μL)以 8×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度加入 96孔板中，在 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h.然后，用20μL 預(yù)先培養(yǎng)的 Aβ40(25μmol/L)、Cu2+(10μmol/L)、不同濃度的多肽處理細(xì)胞，再過(guò) 24h.之后每孔加入10μL MTT溶液(5.5mg/mL)，培養(yǎng) 4h后，用 100μL DMSO代替培養(yǎng)基以溶解晶體.然后，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)量570nm處的吸光度.

通過(guò) MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定多肽對(duì) Cu2+-Aβ40聚集體細(xì)胞毒性的作用.將含有 25μmol/L Aβ40單體和10μmol/L CuCl2在 37℃、150r/min間歇搖動(dòng)的空氣搖床中培養(yǎng)72h 后，加入多肽抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)48h，之后按照相同的方法進(jìn)行 MTT實(shí)驗(yàn).進(jìn)行 5次重復(fù)，并將數(shù)據(jù)平均.以不含細(xì)胞的樣品作為空白組，以僅含有細(xì)胞的樣品作為對(duì)照組(100%)，對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行歸一化.計(jì)算學(xué)生t檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)比較以分析方差，并且p＜0.05或更小被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的.

2 結(jié)果與討論

2.1 SK10對(duì)Cu2+存在下Aβ40聚集的抑制作用

為了考察 SK10對(duì) Cu2+存在下 Aβ40聚集的抑制作用，在此進(jìn)行了 ThT熒光測(cè)定和聚集動(dòng)力學(xué)測(cè)定(見(jiàn)圖1).可以看到，若將單獨(dú)Aβ40聚集的ThT熒光強(qiáng)度定義為100%，那么在Cu2+存在下，不但ThT熒光強(qiáng)度比單獨(dú) Aβ40降低約 40%(見(jiàn)圖 1(a))，而且Aβ40的聚集延遲期縮短到 15h左右(見(jiàn)圖 1(b))，說(shuō)明 Cu2+會(huì)促進(jìn) Aβ40聚集，且形成一種 β-sheets結(jié)構(gòu)較少的聚集體[30-31].當(dāng)加入 SK10后，由于其對(duì) Cu2+具有螯合作用，因此在低濃度(低于12.5 μmol/L)時(shí)，即可減輕Cu2+對(duì)Aβ40的作用，使ThT熒光得到一定恢復(fù)；且隨著 SK10濃度的提高，由于其又可發(fā)揮對(duì)聚集的抑制作用，因此表現(xiàn)出 ThT熒光不斷降低，如：當(dāng) SK10濃度提高到 200μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度降低了 60%左右(見(jiàn)圖 1(a))；從動(dòng)力學(xué)結(jié)果(見(jiàn)圖1(b))發(fā)現(xiàn)，低濃度SK10并不能改變 Cu2+對(duì) Aβ40聚集延遲期的縮短，但當(dāng)濃度大于 100μmol/L時(shí)，延遲期稍有延長(zhǎng).雖然LK7不具有結(jié)合Cu2+的能力(未顯示結(jié)果)，但低濃度仍具有抑制 Aβ40聚集的作用，所以可使熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低；但當(dāng)濃度大于100μmol/L時(shí)，由于其發(fā)生自聚，對(duì) Aβ聚集的抑制作用減弱，熒光強(qiáng)度又有所上升[23].SSH雖然可以螯合Cu2+，但沒(méi)有抑制Aβ40聚集的作用(未顯示結(jié)果)，所以加入 SSH后，只是使 ThT熒光恢復(fù)到與單獨(dú)Aβ40相當(dāng)?shù)某潭?見(jiàn)圖 1(a)).SK10連接 SSH后改善了 LK7的自聚性質(zhì)，即使在高濃度下也能抑制Aβ40聚集(見(jiàn)圖 1(a))，而僅僅通過(guò)單純的 SSH 和LK7的物理混合并不能改變 LK7的自聚，提高抑制作用，所以這是SK10作為Aβ抑制劑的優(yōu)勢(shì).

圖1 多肽抑制劑對(duì)Cu2+存在下Aβ40聚集的影響Fig.1 Effect of peptide inhibitors on Aβ40 aggregation in the presence of Cu2+

圖 2為不同實(shí)驗(yàn)條件下，SK10對(duì) Cu2+存在下Aβ40形態(tài)的影響.可以看到，單獨(dú)的 Aβ40形成大量的纖維結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖 2(a))；當(dāng) Aβ40與 Cu2+共同培養(yǎng)時(shí)，觀察到球形顆粒和少量的短纖維(見(jiàn)圖 2(b))；但當(dāng)加入低濃度的 SK10(12.5μmol/L和 25μmol/L)后，球形顆粒消失，纖維逐漸增加(見(jiàn)圖 2(e)和(f))；隨著 SK10濃度進(jìn)一步增加，纖維不斷減少，添加200μmol/L 時(shí)，纖維完全消失(見(jiàn)圖 2(h)和(i)).這些結(jié)果與 ThT熒光結(jié)果相一致(見(jiàn)圖 1)，說(shuō)明添加200μmol/L的 SK10即可完全抑制 Cu2+存在下 Aβ40聚集.但對(duì)于 SSH而言，由于 SSH只能螯合 Cu2+，不能影響 Aβ40聚集，所以加入 SSH 后，重新出現(xiàn)大量纖維(見(jiàn)圖2(c)和(d)).常數(shù)(Kd)分別為 0.03μmol/L和 0.09μmol/L，表明兩者對(duì) Cu2+的結(jié)合親和力相近.但值得注意的是，對(duì)Cu2+的結(jié)合能力而言，SK10的 Kd值比 Aβ40(2.79μmol/L[33])低了近百倍，說(shuō)明SK10遠(yuǎn)高于Aβ40對(duì) Cu2+的親和力，因此 SK10可以和 Aβ40競(jìng)爭(zhēng)螯合Cu2+，從而抑制Cu2+-Aβ40聚集體的形成.同時(shí)由表1可知，反應(yīng)的吉布斯自由能ΔG小于0，說(shuō)明SK10和SSH與Cu2+的結(jié)合可以自發(fā)進(jìn)行；ΔH和TΔS都小于0，且ΔH的絕對(duì)值大于TΔS，說(shuō)明是一個(gè)焓驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，因此在結(jié)合過(guò)程中，靜電和氫鍵為主要作用力.

圖2 多肽抑制劑和Cu2+存在下Aβ40聚集體的AFM圖像Fig.2 AFM images of Aβ40 aggregation with peptide inhibitors and Cu2+

圖3 多肽抑制劑對(duì)Cu2+的螯合作用Fig.3 Chelation of peptide inhibitors on Cu2+

2.2 SK10對(duì)Cu2+的螯合作用

由于 Cu2+可以淬滅 Aβ40中 Tyr10處的內(nèi)源熒光[32]，加入 Cu2+螯合劑，其可以結(jié)合 Cu2+，使 Aβ40的熒光恢復(fù).因此測(cè)定 Aβ40的酪氨酸熒光變化即可研究 SK10螯合 Cu2+的能力(見(jiàn)圖 3(a)).由圖可以看到，SK10和 SSH都可以使熒光恢復(fù)，且具有濃度依賴性，當(dāng) Aβ40、Cu2+和 SSH/SK10 的摩爾比為 1∶0.4∶0.5時(shí)即可有效抑制熒光猝滅，使熒光恢復(fù)到75%，當(dāng) Aβ40、Cu2+和 SSH/SK10的摩爾比增加至1∶0.4∶4時(shí)，酪氨酸熒光即可恢復(fù)到與對(duì)照Aβ40相當(dāng).而LK7對(duì)熒光幾乎沒(méi)有影響.

為了進(jìn)一步考察SSH和SK10螯合Cu2+的熱力學(xué)行為，在此利用 ITC進(jìn)行了多肽和 Cu2+之間的結(jié)合親和力測(cè)定(見(jiàn)圖 3(b)和圖 3(c))，并計(jì)算它們的熱力學(xué)常數(shù)(見(jiàn)表1)，得到SK10和SSH的解離平衡

表1 Cu2+結(jié)合多肽抑制劑的熱力學(xué)參數(shù)Tab.1 Thermodynamic parameters for Cu2+binding to peptide inhibitors

另外，在對(duì) SK10與其他常見(jiàn)金屬離子(Ca2+、K+、Mg2+和 Zn2+)的結(jié)合親和力考察中發(fā)現(xiàn)，Ca2+、K+、Mg2+和 Zn2+的滴定曲線幾乎沒(méi)有波動(dòng)(未顯示結(jié)果)，這意味著這些金屬離子與 SK10之間幾乎沒(méi)有相互作用.說(shuō)明 SK10可以選擇性地螯合 Cu2+，是一種具有特異性的金屬螯合Aβ聚集抑制劑.也進(jìn)一步證明SSH是對(duì)Cu2+有特異性結(jié)合的三肽螯合劑.

2.3 SK10對(duì)ROS生成的抑制作用

由于 Cu2+會(huì)引發(fā) ROS的形成，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化損傷.在此通過(guò) 3-香豆素三羧酸熒光定，考察了SK10對(duì)Cu2+或Aβ40存在下Cu2+誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的影響(見(jiàn)圖4).圖4(a)顯示了SK10可以抑制Cu2+誘導(dǎo)的 ROS的生成，且存在濃度依賴性.可以看到，隨著SK10與 Cu2+的摩爾比增加，熒光增長(zhǎng)速率減慢并且最終熒光強(qiáng)度逐漸下降，當(dāng)SK10與Cu2+的摩爾比提高到2∶1時(shí)，可以完全抑制ROS的生成.另外從圖4(b)可知，由于 Aβ40也可結(jié)合 Cu2+[34]，使其催化ROS生成減少，導(dǎo)致熒光值降低，但是 25μmol/L Aβ40卻仍然不能完全抑制 ROS的生成.而 SK10對(duì)Aβ40存在下Cu2+引發(fā)的ROS生成速率就有明顯的抑制作用.當(dāng) SK10與 Cu2+的摩爾比提高到 1.25∶1時(shí)，可以完全抑制 ROS 的生成，表明 SK10能有效螯合Cu2+以防止ROS產(chǎn)生.

由于 Cu2+催化的 ROS不僅可以產(chǎn)生氧化損傷，而且可以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞毒性[30,35-36]，在此進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了在 Cu2+與 Aβ40存在下 SK10對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用(見(jiàn)圖5).SK10本身對(duì)SH-SY5Y沒(méi)有細(xì)胞毒性(未顯示結(jié)果)，說(shuō)明 SK10具有良好的生物相容性.由于 Aβ40的神經(jīng)毒性小于 Aβ42，加入 Aβ40的細(xì)胞活力降低到 78%(與文獻(xiàn)[36]中一致)，加入Cu2+后，細(xì)胞活力進(jìn)一步降低到 70%；但隨著加入SK10的濃度不斷提高，細(xì)胞活力逐漸增加，當(dāng)Aβ40、Cu2+和 SK10的摩爾比為 1∶0.4∶4時(shí)，細(xì)胞活力增加至 92%.說(shuō)明 SK10可以有效緩解 Aβ40聚集和Cu2+產(chǎn)生的ROS對(duì)細(xì)胞的毒性.而 LK7由于不能鰲合 Cu2+且其本身由于自聚也會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性[23]，所以完全沒(méi)有緩解細(xì)胞毒性.這是 SK10相比 LK7的明顯優(yōu)勢(shì).

2.4 SK10對(duì)形成的 Cu2+-Aβ40聚集體的解聚作用及其解毒作用

圖4 通過(guò) CCA熒光檢測(cè) SK10和 Aβ40對(duì) Cu2+生成ROS的影響Fig.4 Effects of SK10 and Aβ40 on the ROS production through Cu2+ by measuring CCA fluorescence

圖5 多肽抑制劑對(duì) Cu2+存在下的 Aβ40誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of peptide inhibitors on the cytotoxicity of Cu2+-Aβ40

如上所述，由于 SK10遠(yuǎn)高于 Aβ40對(duì) Cu2+的親和力，因此可以較強(qiáng)地競(jìng)爭(zhēng)鰲合 Cu2+.為了考察SK10對(duì)已形成的 Cu2+-Aβ40聚集體的解聚作用，向培養(yǎng) 3d的 Cu2+-Aβ40聚集體中加入 SSH 或 SK10，以檢測(cè)其解聚動(dòng)力學(xué)(見(jiàn)圖 6).由圖 6(a)可以看出，與對(duì)照相比，加入SK10后，熒光迅速下降，并很快達(dá)到平臺(tái)期，且具有濃度依賴性.雖然加入 SSH后也得到了類似的結(jié)果(見(jiàn)圖 6(b))，但是熒光值下降沒(méi)有SK10明顯.這是因?yàn)镾SH只能螯合Cu2+，卻不能進(jìn)一步作用于解聚后的Aβ40.

圖6 多肽抑制劑對(duì)Cu2+-Aβ40聚集體的解聚作用Fig.6 Effect of peptide inhibitors on Cu2+-Aβ40 deploymerization

進(jìn)一步通過(guò) AFM 觀察 SK10對(duì) Cu2+-Aβ40聚集體形態(tài)的影響(見(jiàn)圖7).當(dāng) Aβ40與 Cu2+共同培養(yǎng)時(shí)，觀察到球形顆粒和少量的短纖維(見(jiàn)圖 2(b)).當(dāng)向Cu2+-Aβ40聚集體中加入 SSH 后(見(jiàn)圖 7(a)和(b))，球形顆粒完全轉(zhuǎn)變?yōu)槎汤w維；加入低濃度SK10后(見(jiàn)圖 7(c))，同樣出現(xiàn)大量短纖維，但是隨著 SK10濃度的提高，纖維逐漸減少，當(dāng)濃度提高到 200μmol/L時(shí)，纖維完全消失(見(jiàn)圖 7(e)和(f)).此進(jìn)一步證明了SK10對(duì)Cu2+-Aβ40聚集體具有解聚作用.

圖8展示了通過(guò)MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的SK10解聚產(chǎn)物的細(xì)胞毒性.可以看到，加入 Cu2+-Aβ40聚集體的細(xì)胞活性為 70%左右，隨著 Aβ40、Cu2+和SK10的增加，細(xì)胞活性可恢復(fù)到 90%左右(n(Aβ40)∶n(Cu2+)∶n(SK10)＝1∶0.4∶8)，說(shuō)明 SK10 能夠通過(guò)解聚 Cu2+-Aβ40聚集體，減小其細(xì)胞毒性.這意味著，SK10不僅可以抑制 Cu2+誘導(dǎo)的 Aβ40的聚集，也可以作用已有的聚集體，以減輕其對(duì)細(xì)胞的毒害作用，表現(xiàn)出更高的實(shí)用價(jià)值.

圖7 加入抑制劑后Cu2+-Aβ40聚集體的AFM圖像Fig.7 AFM images of Cu2+-Aβ40 aggregates with peptide inhibitors

圖8 多肽抑制劑對(duì) Cu2+-Aβ40聚集體細(xì)胞毒性的抑制作用Fig.8 Inhibitiory effect of peptide inhibitors on the cytotoxicity of Cu2+-Aβ40 aggregates

2.5 SK10對(duì)Cu2+存在下Aβ42聚集的抑制作用

圖9 SK10對(duì)Cu2+存在下Aβ42聚集的影響Fig.9 Effect of SK10 on Aβ42 aggregation in the presence of Cu2+

由于 Aβ42聚集速度更快且細(xì)胞毒性更大[37]，所以進(jìn)一步探究了SK10對(duì) Cu2+存在下 Aβ42聚集的抑制作用見(jiàn)圖 9.與圖 1相似，SK10對(duì) Cu2+存在下Aβ42的聚集抑制也十分明顯，且由圖 10可以看到，Cu2+和Aβ42形成球形聚集體(見(jiàn)圖10(b))，當(dāng)加入低濃度 SK10后，球形聚集體減少，纖維增加(見(jiàn)圖10(c))，隨著 SK10濃度提高，纖維逐漸減少至消失(見(jiàn)圖 10(d)～(f)).這些結(jié)果說(shuō)明，SK10不僅對(duì)Cu2+存在下 Aβ40的聚集有抑制作用，而且對(duì) Cu2+存在下Aβ42的聚集也有抑制作用.

圖10 SK10和Cu2+存在下Aβ42聚集體的AFM圖像Fig.10 AFM images of Aβ42 aggregation with SK10 and Cu2+

3 結(jié) 語(yǔ)

本文設(shè)計(jì)了一種雙功能十肽 Aβ聚集和解聚抑制劑SK10.證明了SK10能夠抑制Cu2+存在下的Aβ的聚集，緩解聚集體引起的細(xì)胞毒性，抑制 ROS的產(chǎn)生；值得提出的是，SK10還具有解聚已形成的Cu2+-Aβ40聚集體的作用，減輕已形成的 Cu2+-Aβ40聚集體的細(xì)胞毒性.另外，SK10可選擇性地螯合金屬離子Cu2+，對(duì)Cu2+具有強(qiáng)親和力和特異性.上述結(jié)果說(shuō)明，本研究設(shè)計(jì)合成的雙功能 Aβ聚集和解聚抑制劑(SK10)不僅在 AD治療和預(yù)防藥物的開(kāi)發(fā)上有很大的潛力，而且可為進(jìn)一步研發(fā)多功能 Aβ聚集抑制劑提供新的思路.