趙萬隆，程偉，陳劍

1.上海市青浦食品藥品檢驗所，上海 201799；2.信陽市食品藥品檢驗所，河南 信陽 464000

通降湯處方是由中醫(yī)師依據(jù)多年臨床實踐經(jīng)驗總結(jié)并開發(fā)的醫(yī)療機構(gòu)制劑，由大黃、黨參、丹參、當歸、白術(shù)、附片、干姜、甘草等藥材組成的中藥制劑，具有溫陽健脾、泄?jié)峄龅墓π?，主要用于脾腎陽虛、濕濁內(nèi)蘊所致的畏寒肢冷、倦怠乏力、食少納呆、脘腹脹滿、腰膝酸軟，慢性腎功能衰竭見上述證候者。大黃為方中君藥，現(xiàn)代藥理研究表明，大黃具有調(diào)節(jié)胃腸功能、保護心腦血管、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫力等藥理作用[1]。氮代謝紊亂是慢性腎衰竭患者的突出表現(xiàn)，大量實驗和臨床研究均證明，大黃具有改善氮代謝的作用[2]。有研究表明，大黃素可促進骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)的表達，從而發(fā)揮延緩腎間質(zhì)纖維化進程的作用，對腎纖維化有一定的治療作用[3]。當歸具有防治腎缺血再灌注損傷的作用[4]，研究表明，經(jīng)過當歸補血顆粒治療的大鼠，肌酐和尿素氮明顯減低，并改善腎組織和蛋白表達[5]。丹參中丹酚酸B能抑制腎小球濾過率大鼠腎皮質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子含量的增加，并能減少內(nèi)皮素與腎皮質(zhì)細胞內(nèi)皮素(endothelin，ET)的合成與釋放，使得腎血管舒張，血流量增多，改善腎功能[6]。為了有效地控制本制劑的質(zhì)量，本研究采用TLC對處方中君藥大黃進行定性鑒別，同時建立高效液相色譜法對制劑中阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸銨和大黃素的含量測定，以此建立通降湯的質(zhì)量標準。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀；梅特勒電子天平；德國普蘭德移液槍(5、1 mL)。

1.2 試藥

大黃素對照品、阿魏酸對照品、丹酚酸B對照品、甘草酸銨對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110756-201512、110773-201313、111562-201514、110731-201619)；流動相溶液為色譜純；其余試劑均為分析純。

通降湯由信陽市中醫(yī)院制劑室提供(批號分別為20171216、20180622、20180919)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

取通降湯樣品30 mL，用乙醚振搖萃取2次，每次使用乙醚30 mL，合并乙醚液，揮干，取無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺大黃的陰性樣品30 mL，同法制成陰性樣品溶液。再取大黃素對照品，加無水乙醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品、對照品和陰性樣品3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干。在與對照品色譜相應的位置上，供試品色譜應顯相同的黃色斑點[7]；置氨蒸氣中熏后，斑點變?yōu)槌燃t色，且陰性樣品在相應位置上無相同顏色斑點，說明陰性無干擾。見圖6。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 安捷倫ZORBAX-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A-乙腈，B-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～5 min，20%A；5～15 min，20%～30%A；15～30 min，30%～50%A；30～45 min，50%A)；檢測波長：0～14 min為321 nm(阿魏酸)，14～22 min為286 nm(丹酚酸B)，22～35 min為250 nm(甘草酸銨)，35～45 min為254 nm(大黃素)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

注：A.氨蒸氣熏前；B.氨蒸氣熏后；1.大黃素；2～4.樣品；5.陰性。圖1 大黃薄層色譜圖

2.2.2 對照品溶液 分別精密稱定阿魏酸對照品、丹酚酸B對照品、大黃素對照品和甘草酸銨對照品適量，以甲醇作為稀釋溶劑定容，制成質(zhì)量濃度分別為626.8、471.2、413.6、584.0 μg·mL-1的對照品儲備溶液，分別各精密吸取1、2、1、1 mL置于50、25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；再分別吸取4個對照儲備溶液0.5、1、0.5、0.5 mL置于25、10、5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。共得到5個濃度級別的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密量取本品5 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇15 mL，振搖處理2 min，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置30 min后，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方比例和制備工藝分別制備不含當歸、丹參、甘草和大黃的陰性樣品，再按2.2.3項下方法分別制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察

取2.2.2項下混合對照品溶液、2.2.3項下供試品溶液、2.2.4項下陰性樣品溶液，在2.2.1項下的色譜條件下測定，記錄色譜圖(見圖2)。結(jié)果顯示，供試品中在與對照品色譜上相同保留時間的位置有相同的色譜峰，陰性樣品色譜在相同保留時間無色譜峰，證明陰性樣品無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.2項下的不同濃度的混合對照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.2.1項下的規(guī)定條件測定，記錄峰面積并建立標準曲線方程，橫坐標為4種成分的濃度(μg·mL-1)，縱坐標為峰面積，得到阿魏酸的回歸方程為Y=26.308X+5.366 4(r=0.999 9)，丹酚酸B的回歸方程為Y=18.208X+3.145 4(r=0.999 9)，甘草酸銨的回歸方程為Y=11.909X+1.087(r=0.999 9)，大黃素的回歸方程為Y=20.757X+0.250 6(r=0.999 9)。結(jié)果表明，阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸銨和大黃素的進樣質(zhì)量濃度分別在3.13～62.68、4.71～94.24、2.92～58.40、2.07～41.36 μg·mL-1有著較好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取2.2.1項下的混合對照品溶液10 μL(阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸銨、大黃素質(zhì)量濃度分別為31.34、47.12、29.20、20.68 μg·mL-1)，連續(xù)進樣6次，按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。通過計算得到阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸銨和大黃素峰面積的RSD分別為0.4%、0.2%、0.5%和0.7%，表明該高效液相色譜儀的精密度較好。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.不含當歸的陰性樣品；D.不含丹參的陰性樣品；E.不含甘草的陰性樣品；F.不含大黃的陰性樣品；1.阿魏酸；2.丹酚酸B；3.甘草酸銨；4.大黃素。圖2 通降湯及對照品HPLC圖

2.6 穩(wěn)定性試驗

取通降湯供試品溶液，在過濾罐瓶0、2、4、8、12、24 h后上注入高效液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸銨和大黃素峰面積RSD分別為0.8%、0.4%、1.1%和1.2%。表明24 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性較好。

2.7 重復性試驗

取通降湯樣品(20171216)，平行處理6份，按2.2.3項下供試品溶液處理方法得到供試品溶液，上機測定，記錄峰面積并計算阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸銨和大黃素的含量。通過計算，含量分別為0.125、0.471、0.116、0.083 mg·mL-1，RSD分別為1.0%、1.3%、0.8%和1.2%，表明該方法重復性較好。

2.8 加標回收率試驗

取9份通降湯樣品(20171216)的樣品2.5 mL，分別加入一定量的對照品，按2.2.3項下供試品溶液處理方法制備加標供試溶液，上機測定，記錄峰面積，計算各成分回收率。通過計算，阿魏酸、丹酚酸B、甘草酸銨和大黃素的平均加樣回收率分別為97.6%(RSD=2.3%)、98.6%(RSD=1.0%)、97.7%(RSD=1.7%)和98.1%(RSD=1.3%)，見表1。

2.9 含量測定

取3批通降湯樣品，按規(guī)定的方法制備供試品溶液，以摸索好的色譜條件上機測定，記錄峰面積，計算含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 TLC條件的優(yōu)化

在TLC試驗中，分別嘗試了乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯等試劑進行成分提取，除乙醚外其他試劑與藥液發(fā)生乳化現(xiàn)象，且各種方法都無法有效破乳，故選擇乙醚作為提取溶劑。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)為展開劑，展開晾干后檢視，結(jié)果薄層色譜顯色效果較好，經(jīng)氨蒸氣熏后，斑點由黃色漸變?yōu)槌燃t色，且陰性樣品無干擾。

3.2 波長的選擇

本方法在檢測波長的選擇上，參考待測成分的相關(guān)文獻[8-12]，按各成分保留時間的不同設(shè)置波長數(shù)：0～14 min為321 nm，檢測阿魏酸；14～22 min為286 nm，檢測丹酚酸B；22～35 min為250 nm，檢測甘草酸銨；35～45 min為254 nm，檢測大黃素，此方法下4個成分都能有較大紫外吸收。而采用單一波長時，只有部分成分紫外吸收較大，其余成分不能得到最大吸收，個別成分甚至沒有吸收無法計算和定量，當選擇波長切換法，使4個成分在各自的保留時間有最大吸收波長，使定量結(jié)果更加準確。

表1 通降湯中各成分的加標回收率試驗結(jié)果(n=9)

表2 通降湯中各成分的含量測定結(jié)果(n=3) mg·mL-1