楊莎莎，周利

湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬太和醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 十堰 442000

糖尿病腎病(DN)的特征在于腎炎、尿白蛋白、腎小球濾過率降低、腎小球硬化癥和腎間質(zhì)纖維化，是終末期腎病(ESRD)的主要原因。因此，探索介導(dǎo)DN的機制對于緩解DN的預(yù)防和治療策略至關(guān)重要[1]。白藜蘆醇(RSV)是一種天然多酚化合物，存在于各種水果中，如葡萄、堅果、漿果以及紅葡萄酒。以前的研究表明，RSV具有多種有益的健康效果，包括抗氧化、抗炎、抗癌、心臟保護和神經(jīng)保護活動。關(guān)于糖尿病腎病，以前的報道表明RSV可以改善腎功能不全和病理改變，以及通過體內(nèi)糖尿病條件下的多種信號通路阻止高葡萄糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞增殖和腎小球纖維連接蛋白的表達[2]?，F(xiàn)已有研究報道指出，白藜蘆醇對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡具有保護作用，從而對糖尿病腎病起保護作用[3-4]。

糖尿病患者的死亡率很高。由高血糖引起的線粒體功能障礙有助于DN發(fā)生發(fā)展，其原理可能與活性氧(ROS)過度產(chǎn)生和腺苷三磷酸(ATP)產(chǎn)生的降低有關(guān)，尤其是在腎小管上皮細胞。近端腎小管主要作用水的重吸收、葡萄糖及電解質(zhì)(鈉離子)運輸，這些都需要大量的ATP。而ATP主要來源于細胞內(nèi)的線粒體。當細胞受到損害(氧化應(yīng)激)，線粒體功能障礙導(dǎo)致ATP產(chǎn)出減少。因此，腎氧化應(yīng)激是DN重要的發(fā)病機制之一，抑制腎氧化應(yīng)激可有效地治療DN，這為其治療提供了新切入點[5]。

磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶(PI3K)蛋白激酶B(Akt)途徑即PI3K/Akt，是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、衰老、抗氧化的關(guān)鍵信號通路[6]。研究表明，PI3K/Akt通路對氧化應(yīng)激及其引起的凋亡起著重要的保護作用[7]。大量研究報道指出，白藜蘆醇具有抗氧化應(yīng)激的作用[8]?；谏鲜鰣蟮溃狙芯坎捎酶咛钦T導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷作為模型，探討白藜蘆醇是否通過激活PI3K/Akt通路抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而對腎小管上皮細胞發(fā)揮保護作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

白藜蘆醇(南京景竹生物科技有限公司，批號：JS190524，純度：99%)。腎小管上皮細胞(HK-2,南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

胎牛血清(美國Earthox公司)、胰酶和DMEM培養(yǎng)基(上海翊圣生物科技公司)；MTT試劑盒(沈陽萬類生物科技公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自南京建成生物公司；JC-1(線粒體膜電位)試劑盒購自AAT Bioquest；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(Annexin-V/PI)細胞凋亡檢測試劑盒(沈陽萬類生物科技公司)；二氫乙錠(DHE，美國AAT Bioquest公司)；抗體磷酸化Akt(p-Akt)、Akt、細胞色素C(CYT-C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)購自沈陽萬類生物科技公司；LY294002(美國APExBIO公司)。

1.2 儀器

立式壓力蒸氣滅菌器(上海三中醫(yī)療器械有限公司)，干燥箱(上海?，攲嶒炗邢薰?，超凈工作臺(蘇凈集團有限公司)，二氧化碳孵箱(美國Thermo Fisher公司)，熒光顯微鏡(德國 Leica公司)，高速臺式大容量離心機(德國HERMLE公司)，多頭磁力攪拌器(江蘇中大儀器廠)，超聲波破碎機(美國SONICS公司)，制冰機(日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社)，優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(新加坡優(yōu)普公司)，流式細胞儀(美國BD FACSCelestaTM公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組

腎小管上皮細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞達到90%左右的融合度時，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗分組(平行孔數(shù)n=5)：空白對照組；模型組(培養(yǎng)基中加入30 mmol·L-1高糖孵育8 h)；白藜蘆醇低、高濃度組(培養(yǎng)基中分別先加入5、10 μmol·L-1白藜蘆醇孵育4 h，再加入30 mmol·L-1高糖孵育8 h)；PI3K抑制劑組(10 μmol·L-1白藜蘆醇和10 μmol·L-1PI3K抑制劑LY294002共同處理4 h，再加入30 mmol·L-1高糖孵育8 h)。

2.2 MTT法檢測細胞活力

將細胞以1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中。按本實驗設(shè)計的分組及給藥方法培養(yǎng)后，去上清液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液90 μL、MTT 10 μL(5 g·L-1)，培養(yǎng)4 h；然后棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，搖床中振搖15 min后，在酶標儀492 nm波長處測定吸光度值。根據(jù)每組細胞的吸光度(A)值計算細胞活力。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化

按實驗設(shè)計處理各細胞組后，消化、離心、收集細胞。用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為5×105個/L。按照Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明，在每組細胞中加入5 μL的Annexin-V及10 μL的PI，反應(yīng)15 min，加入300 μL緩沖液，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。Q1：壞死細胞比例；Q2：晚期細胞凋亡比例；Q3：正常細胞比例；Q4：早期細胞凋亡比例。其中總凋亡率=Q2+Q4。

2.4 DHE熒光探針檢測腎小管上皮細胞中ROS的變化

根據(jù)文獻中的方法[9]，將腎小管上皮細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板中。分組、給藥同上，24 h后棄去上清液，PBS洗3次，加入10 μmol·L-1的DHE，37 ℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。使用Imge-pro plus 6軟件分析，結(jié)果以熒光強度表示。

2.5 JC-1檢測線粒體跨膜電位(MMP)

將腎小管上皮細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板中。實驗分5組：空白對照組、模型組、白藜蘆醇組(濃度為5、10 μmol·L-1)、PI3K抑制劑組。細胞培養(yǎng)和處理方法同2.1，培養(yǎng)結(jié)束后，加入1 mL的JC-1染色工作液(5 mg·L-1)，在細胞培養(yǎng)箱中于37 ℃溫育20 min，然后用JC-1染色緩沖液洗滌兩次，同時加入細胞培養(yǎng)液。利用倒置熒光顯微鏡觀察熒光，測量紅色和綠色熒光強度以了解細胞線粒體膜電位(ΔΨM)的變化。正常線粒體顯示紅色熒光，當ΔΨM降低時，顯示綠色熒光。使用Imge-pro plus 6.0軟件分析。聚集體和單體JC-1的比例用于量化線粒體膜電位的變化。

2.6 腎小管上皮細胞抗氧化指標測定

收集各組細胞上清液，按照試劑盒說明書檢測LDH、MDA、SOD、GSH-PX含量變化。

2.7 免疫印跡法(Western-blot)測定蛋白表達

按實驗設(shè)計處理細胞后，棄去上清液，收集各組細胞置于裂解液(RIPA+1 mmol·L-1PMSF)中(4 ℃)。各組的樣本蛋白濃度通過BCA蛋白定量測定腎小管上皮細胞中的蛋白濃度。添加5×的上樣緩沖液，在沸水中放置4 min。40 μg蛋白在8%～12% SDS-PAGE中，85 V的條件下2 h，然后通過半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜15 V、20 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜在1%BSA中室溫封閉2 h。添加一抗p-Akt、Akt、CYT-C、Caspase-3一抗(1∶1000)，4 ℃過夜。TBST清洗3次，每次5 min。PVDF膜在室溫下孵育二抗2 h。TBST清洗3次，每次5 min。通過ECL顯影液進行顯影。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞活力的影響

MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，高糖損傷組活力顯著降低(P<0.01)，而白藜蘆醇組細胞活力明顯上升(P<0.01)。LY294002組結(jié)果與白藜蘆醇高濃度組相反(P<0.01)。實驗結(jié)果說明白藜蘆醇可以增強腎小管上皮細胞的活力，而LY294002能阻止這種效果(見表1)。

表1 白藜蘆醇對細胞活力的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與白藜蘆醇高濃度組比較，##P<0.01，下同。

3.2 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，高糖損傷組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01，與對照組比較)；而不同濃度的白藜蘆醇組細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)；PI3K抑制劑組結(jié)果與白藜蘆醇高濃度組相反(P<0.01)；說明白藜蘆醇能減少高糖作用后腎小管上皮細胞的凋亡率，而LY294002能阻止這種效果(見圖1、表2)。

圖1 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞凋亡率的影響

表2 白藜蘆醇對細胞凋亡率的影響

3.3 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞ROS的影響

DHE熒光探針檢測顯示，高糖損傷組腎小管上皮細胞ROS顯著升高(P<0.01)，而白藜蘆醇組ROS含量則明顯降低(P<0.01)，PI3K抑制劑組結(jié)果與白藜蘆醇高濃度組相反(P<0.01)。實驗表明，白藜蘆醇可以在高糖作用后減少腎小管上皮細胞中ROS的產(chǎn)生，而LY294002可以阻止這種作用(見圖2，表3)。

圖2 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞的ROS影響

表3 白藜蘆醇對細胞ROS的影響

3.4 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞線粒體膜電位(MMP)的影響

JC-1檢測白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞線粒體膜電位的變化檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組(高糖損傷組)腎小管上皮細胞線粒體膜電位顯著下降(P<0.01)；而不同濃度白藜蘆醇組細胞線粒體膜電位隨濃度梯度逐漸上升(P<0.01)；PI3K抑制劑組與白藜蘆醇組結(jié)果相反(P<0.01)(見圖3、表4)。

表4 白藜蘆醇對腎小管上皮細胞膜電位(MMP)的影響

3.5 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，高糖損傷組LDH、MDA含量顯著增加，SOD、GSH-PX活性顯著下降(與對照組相比，P<0.01)；白藜蘆醇具有改善細胞抗氧化能力，各組LDH、MDA含量逐漸下降，SOD、GSH-PX活性逐漸上升(P<0.01)。PI3K抑制劑組結(jié)果與高濃度白藜蘆醇組相反(P<0.01)(見表5)。

圖3 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞線粒體膜電位的影響

分組劑量/μmol·L-1LDH/U·L-1MDA/nmol·mg-1SOD/U·mg-1GSH-PX/U·mg-1空白對照組252.8±44.7??2.13±0.23??38.1±2.2??146.1±16.3??高糖損傷組(模型組)30974.5±129.14.49±0.2814.3±1.462.5±12.9白藜蘆醇低濃度組5727.6±164.4?3.65±0.34?22.7±3.5?85.4±13.4?白藜蘆醇高濃度組10478.2±175.8??2.66±0.17??34.5±4.1??116.7±18.2??PI3K抑制劑組10+10955.3±156.9##4.37±0.25##15.2±1.7##61.2±10.7##

3.6 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞CYT-C、Caspase-3、p-Akt/Akt蛋白表達的影響

Western-blot分析顯示，模型組腎小管上皮細胞中p-Akt/Akt的表達顯著低于空白對照組(P<0.01)。白藜蘆醇恢復(fù)了細胞p-Akt/Akt的表達(P<0.01)，抑制劑發(fā)揮效應(yīng)，阻止這種作用。模型組中CYT-C、Caspase-3的表達升高，白藜蘆醇可以降低CYT-C、Caspase-3的表達(P<0.01)，PI3K抑制劑組結(jié)果與之相反。提示白藜蘆醇可能通過上調(diào)p-Akt/Akt的表達來降低CYT-C、Caspase-3的表達，而LY294002可以阻止這種作用。因此，白藜蘆醇抑制氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)凋亡的機制與PI3K/Akt通路密切相關(guān)(見圖4、表6)。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.白藜蘆醇低濃度組；D.白藜蘆醇高濃度組；E.PI3K抑制劑組。圖4 白藜蘆醇對高糖作用后腎小管上皮細胞中CYT-C、Caspase-3、p-Akt/Akt蛋白表達的影響

4 討論

糖尿病已成為全球主要的公共衛(wèi)生問題之一。在中國，糖尿病在成年人中的患病率達到了10.9%。DN是糖尿病的常見慢性微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的重要原因。同時，糖尿病患者大約40%有DN。腎小球結(jié)構(gòu)肥大、腎小球基底膜增厚、系膜細胞增生、腎小管間質(zhì)擴張以及細胞外基質(zhì)(ECM)成分(如膠原和纖維連接蛋白)的異常積聚是DN的主要病理特征。膠原纖維的增加是腎纖維化的主要特征。在此過程中，腎臟經(jīng)歷過多的膠原沉積，導(dǎo)致腎實質(zhì)逐漸硬化和瘢痕形成，最終導(dǎo)致腎功能完全喪失[10]。本研究在體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞，發(fā)現(xiàn)用高糖刺激能明顯增加腎小管上皮細胞的凋亡。氧化應(yīng)激被認為是糖尿病腎病共同的發(fā)病途徑[11]。

糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中，活性氧扮演著重要角色[12]。有報道指出，氧化應(yīng)激引起的腎小管上皮細胞凋亡，活性氧在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。在高糖環(huán)境下ROS產(chǎn)生過多，會導(dǎo)致核酸斷裂、酶失活、多糖解聚、脂質(zhì)過氧化和許多其他破壞性過程，最終會導(dǎo)致細胞凋亡。本實驗中，白藜蘆醇降低了高糖作用后腎小管上皮細胞ROS含量。LDH、MDA、SOD、GSH-PX代表著細胞的氧化應(yīng)激的水平。本實驗中，模型組LDH和MDA升高，而不同濃度的白藜蘆醇組LDH和MDA含量逐漸下降，證明白藜蘆醇可以減少細胞氧化應(yīng)激。

PI3K/Akt途徑是細胞周期過程中非常重要的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。它與細胞靜止、增殖、癌癥和長壽等有關(guān)[14]。PI3K活化磷酸化并進一步激活A(yù)kt，Akt定位于細胞膜。活化的Akt具有多種生物學(xué)功能，包括激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，抑制p27，在細胞質(zhì)中定位叉頭盒蛋白O(FOXO)，激活磷脂酰肌醇3-磷酸(PtdIns3ps或PI3P)和激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。已經(jīng)確定PI3K/Akt途徑可以通過幾種生物分子增強，包括表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-1和胰島素鈣調(diào)蛋白。相反，該途徑被其他分子拮抗，包括PTEN、糖原合成酶激酶3β和轉(zhuǎn)錄因子HB9。PI3Ks是脂質(zhì)激酶家族，通過磷脂酰肌醇(PI)的特異性催化3-羥基磷酸化產(chǎn)生第二信使[15]。PI3K/Akt信號途徑的磷酸化作用生成p-Akt而被激活，抵抗細胞的氧化應(yīng)激損傷[16]。在我們的研究中，白藜蘆醇激活PI3K/Akt通路，這是抑制氧化應(yīng)激及其介導(dǎo)的細胞凋亡的潛在機制。

分組劑量/μmol·L-1p-Akt/AktCYT-C/β-actinCaspase-3/β-actin空白對照組1.19±0.21??0.26±0.12??0.35±0.12??高糖損傷組(模型組)300.23±0.101.16±0.171.29±0.21白藜蘆醇低濃度組50.49±0.16?0.73±0.13?0.82±0.15?白藜蘆醇高濃度組101.02±0.18??0.41±0.11??0.47±0.13??PI3K抑制劑組10+100.25±0.09##0.99±0.14##1.26±0.17##

綜上所述，白藜蘆醇部分可能通過激活PI3K/Akt通路抑制了高糖介導(dǎo)的腎小管上皮細胞氧化損傷及凋亡。