張荷玲，閆 凱

（山西大學(xué)體育學(xué)院，山西 太原 030006）

21世紀(jì)以來(lái)，肥胖逐漸成為流行病之一，預(yù)防和治療肥胖，已經(jīng)成為當(dāng)今國(guó)際社會(huì)備受重視的問(wèn)題。截止到2013年，全球肥胖人口總數(shù)已超過(guò)21億，而我國(guó)目前肥胖和超重人數(shù)就位列美國(guó)之后，處于全球第二。肥胖能夠?qū)е露喾N疾病的發(fā)生，如高血壓，高血脂及冠心病等。瘦素可以作為肥胖人口的一個(gè)重要的心血管疾病標(biāo)記，并且用于評(píng)估個(gè)人代謝風(fēng)險(xiǎn)。

下丘腦是內(nèi)分泌的高級(jí)活動(dòng)中樞，通過(guò)一系列激素的基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的內(nèi)分泌，還能夠參與調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)，比如體溫，水鹽平衡，睡眠，攝食等多種行為。研究表明，Leptin還是一種多靶器官，參與體內(nèi)多種代謝調(diào)節(jié)，Leptin發(fā)揮它的中樞作用會(huì)通過(guò)與下丘腦OB-R結(jié)合，影響神經(jīng)內(nèi)分泌激素的分泌，從而引起一系列的生理反應(yīng)并且作用于肥胖機(jī)體。已有研究表明，肥胖的發(fā)生與瘦素有著密切的聯(lián)系，瘦素是由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，在與特異性受體結(jié)合后，通過(guò)中樞作用發(fā)揮它的生物學(xué)特性。

本研究著重研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠下丘腦瘦素表達(dá)的影響，通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠下丘腦瘦素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響，探索有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)下丘腦瘦素表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)減肥提供更多的有價(jià)值的參考信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從軍事科學(xué)院購(gòu)進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠60只，統(tǒng)一為雌性，體重質(zhì)量在180～200g，每6只一籠進(jìn)行飼養(yǎng)，自由飲食。先喂養(yǎng)1周，讓大鼠先適應(yīng)這個(gè)環(huán)境。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分組，分為普通對(duì)照組和高脂模型組，其中普通對(duì)照組10只，高脂模型組50只。普通對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料；高脂模型組給予高熱量飼料。飲食自由進(jìn)行，不加限制。每周記錄體重及體長(zhǎng)的變化，并記錄每日的飲食量。8周后，挑選符合實(shí)驗(yàn)要求的肥胖大鼠，隨機(jī)分組，每組6只，建立肥胖大鼠游泳模型。普通組的喂養(yǎng)飼料為購(gòu)進(jìn)的普通鼠糧，熱量大概為15 kj/g，高脂組的飼料在基礎(chǔ)飼料中需要額外加入蔗糖、豬油、雞蛋黃、食鹽等，熱量為21kj/g。

1.2 動(dòng)物分組

選取符合實(shí)驗(yàn)要求高脂模型組的大鼠隨機(jī)分為肥胖對(duì)照組（A1）、6周運(yùn)動(dòng)后即刻組（B1）、6周運(yùn)動(dòng)后3h組（B2）3組，每組6只；普通對(duì)照組的選取6只符合要求的分為正常對(duì)照組（A2），總共4組，每組6只。

1.3 運(yùn)動(dòng)和控食計(jì)劃

A1：高脂飼料飼養(yǎng)大鼠，不運(yùn)動(dòng)。A2：普通飼料飼養(yǎng)大鼠，不運(yùn)動(dòng)。B1：游泳訓(xùn)練6周即刻取材組，第1周的飲食不需要人為干預(yù)，自主進(jìn)食。從第2周開(kāi)始，大鼠每天的飲食量要限制，需降到前1個(gè)星期每天平均飲食量的80%，同樣也是自由飲食。第3個(gè)星期和第四個(gè)星期的飲食量相同，都是降到第1個(gè)星期每天飲食量的75%。第5個(gè)星期和第6個(gè)星期的飲食量則降為第1個(gè)星期日均進(jìn)食的70%。進(jìn)行游泳訓(xùn)練42 d，每周要有連續(xù)6 d的游泳訓(xùn)練，休息1 d，每天要按時(shí)有1 h的游泳訓(xùn)練。B2：實(shí)驗(yàn)方案同B1組，在最終的有氧訓(xùn)練結(jié)束后讓大鼠休息3h并按時(shí)取材。

先讓大鼠進(jìn)行3d的適應(yīng)性有氧訓(xùn)練，游泳時(shí)間依次增加，到第4 d的時(shí)候，游泳訓(xùn)練正常開(kāi)始，為每天1 h。泳池中的水保持恒溫，在30℃左右。游泳訓(xùn)練期間，大鼠要按照分組正常飲食。

1.4 樣本的采集

按實(shí)驗(yàn)分組依次將肥胖對(duì)照組，6周后即刻組，6周后3 h組和正常對(duì)照組將相對(duì)應(yīng)的大鼠的頭部用手術(shù)刀取下，然后馬上用工具將大鼠的顱骨打開(kāi)，把腦組織分離頭部，然后把下丘腦與其他組織分開(kāi)，即時(shí)放在冰上，然后存入提前準(zhǔn)備好凍存管中，最終需要用液態(tài)氮冷藏以備實(shí)驗(yàn)所需。

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 主要試劑5%BSA封閉液；二抗：生物素化山羊抗兔I gG；SABC：鏈霉親和素——生物素——過(guò)氧化物酶復(fù)合物；免疫組化專用PBS；枸櫞酸鹽緩沖液。

1.5.2 主要儀器電熱恒溫水浴鍋、恒溫箱、搖擺箱等。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法采用博士德生物科技有限公司提供的免疫組化方法，并結(jié)合已有經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，主要有以下步驟：（1）將切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水；（2）進(jìn)行熱抗原修復(fù)；（3）滴加IgG，孵育30 min；再滴加SABC，并孵育30 min；（4）滴加顯色試劑；（4）制作完成后光學(xué)顯微鏡下40倍觀察，能夠觀測(cè)到下丘腦細(xì)胞中有棕褐色陽(yáng)性顆粒。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)切片取5個(gè)視野，對(duì)視野內(nèi)染色成功的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間t檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，肥胖對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量高于正常對(duì)照組并有顯著性差異（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)后即可組和運(yùn)動(dòng)后3 h組與正常對(duì)照組均有非常顯著性差異（P＜0.01），運(yùn)動(dòng)后即刻組和運(yùn)動(dòng)后3h組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于肥胖對(duì)照組，且有顯著性差異（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)后即刻組與運(yùn)動(dòng)后3 h組相比較，沒(méi)有顯著性差異。

表1 下丘腦陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ±s

表1 下丘腦陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ±s

注：*表示與正常對(duì)照組相比較P＜0.05，**表示P＜0.01；#表示與肥胖對(duì)照組相比，P＜ 0.05。

組別 陽(yáng)性細(xì)胞/個(gè)16.8±4.02 21.5±5.26*31.1±8.61**#28.5±7.85**#正常對(duì)照組肥胖對(duì)照組運(yùn)動(dòng)后即刻組運(yùn)動(dòng)后3 h組

2.2 分析與討論

2.2.1 肥胖對(duì)大鼠下丘腦瘦素細(xì)胞表達(dá)量的影響大鼠肥胖后，會(huì)導(dǎo)致其下丘腦瘦素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的明顯增高，不僅如此，許多研究表明，肥胖還會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)瘦素水平的升高。并且由于肥胖引起的中樞過(guò)多瘦素能使大鼠從正常生理轉(zhuǎn)向肥胖相關(guān)性的高血壓。周芯 通過(guò)對(duì)肥胖大鼠的血清瘦素進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，肥胖組的大鼠血清濃度顯著高于正常組，這在多篇文獻(xiàn)報(bào)道中均有闡述，可見(jiàn)體脂量的增多可以增加體內(nèi)瘦素的分泌量，從而作用于機(jī)體，影響攝食和能量消耗。劉志誠(chéng)通過(guò)對(duì)肥胖患者血清瘦素測(cè)定表明，單純性肥胖患者血清瘦素顯著高于正常水平，并由此推出該肥胖患者患有高瘦素?cái)⊙Y 。在經(jīng)過(guò)治療后，肥胖大鼠的血清瘦素水平明顯降低，而下丘腦OB-Rb基因表達(dá)水平升高，有效改善了機(jī)體的瘦素抵抗?fàn)顟B(tài) 。而有進(jìn)一步的研究表明，高脂膳食誘導(dǎo)的瘦素抵抗多發(fā)生在紅肌，并且能夠降低紅肌的脂肪代謝 。在本實(shí)驗(yàn)中，由高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠，其下丘腦瘦素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增高，可見(jiàn)下丘腦已經(jīng)對(duì)機(jī)體肥胖作出相應(yīng)的生理反應(yīng)，但我們認(rèn)為由于某些因素，雖然下丘腦瘦素細(xì)胞的表達(dá)量增高，但并沒(méi)有真正的作用于機(jī)體，這里應(yīng)該是由于肥胖造成了機(jī)體的瘦素抵抗。

2.2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)下丘腦瘦素細(xì)胞表達(dá)量的影響已有研究表明，運(yùn)動(dòng)可以有效降低血清瘦素和增加脂聯(lián)素水平，從而證明有氧運(yùn)動(dòng)治療肥胖的積極作用 ，并且正常有氧運(yùn)動(dòng)中大鼠海馬區(qū)瘦素水平和瘦素受體表達(dá)與海馬區(qū)胰島素生長(zhǎng)因子Ⅰ的水平呈正相關(guān) 。8周的游泳訓(xùn)練可以有效提高瘦素受體基因表達(dá)量的增加，使瘦素和受體結(jié)合效率提高，從而減輕瘦素抵抗 。也有研究者通過(guò)測(cè)定最大攝氧量判斷運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的方法或進(jìn)行通過(guò)力竭運(yùn)動(dòng)，觀察體內(nèi)瘦素含量，證實(shí)要真正改變體內(nèi)瘦素的水平，短時(shí)間的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練并不會(huì)有顯著作用 。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)六周的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，即刻組大鼠下丘腦瘦素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且在運(yùn)動(dòng)后3h其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與即刻組沒(méi)有明顯差異，可見(jiàn)六周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠明顯改善下丘腦瘦素的表達(dá)量，并且降低了大鼠的體脂，對(duì)瘦素抵抗?fàn)顟B(tài)有了明顯的改善。

3 結(jié) 論

肥胖大鼠下丘腦瘦素的表達(dá)量明顯增高，但是體重并沒(méi)有減輕，這可能和瘦素抵抗有關(guān)系；運(yùn)動(dòng)結(jié)合控食能夠有效增加下丘腦瘦素細(xì)胞的表達(dá)量，并使機(jī)體的體重恢復(fù)正常，從而機(jī)體達(dá)到減肥的目的。