謝唐貴 陳敬民 李燕婧 藍保強 蔣珍藕

(1 廣西中醫(yī)藥研究院藥理所，南寧市 530022，電子郵箱：505076561@qq.com；2 廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，南寧市 530022；廣西中醫(yī)藥研究院3 制劑中心，4 中藥所，南寧市 530022)

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，可治療陰虛火旺、胃陰不足、口干煩渴、熱病津傷、骨蒸勞熱、目暗不明等癥[1]。研究顯示，鐵皮石斛有祛疲勞、提高免疫力、保肝、降血糖和促進消化等作用[2]，但目前尚無相關(guān)藥理作用與其化學(xué)成分之間的關(guān)聯(lián)性研究報道。近年來提出的“譜-效”分析研究[3]，是指應(yīng)用指紋圖譜和統(tǒng)計學(xué)方法分析中藥的化學(xué)成分與其藥效的關(guān)系，是闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要手段之一。免疫調(diào)節(jié)是鐵皮石斛發(fā)揮滋陰功效的藥理作用之一。本文以免疫低下小鼠巨噬細胞的吞噬能力作為藥效考察指標，以指紋圖譜表達鐵皮石斛物質(zhì)組分，采用偏最小二乘回歸法(partial least squares regression,PLSR)分析兩者間的關(guān)聯(lián)性，探討鐵皮石斛中具有增強免疫功能的物質(zhì)，為鐵皮石斛的開發(fā)與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 主要儀器 LC-20AT型高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀以及Shim-pack VP-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)均購于島津公司， 1510型酶標儀購于Thermo Fisher公司。

1.2 藥材 鐵皮石斛的產(chǎn)地分別為廣西凌云縣、廣西容縣、廣西桂林市、云南文山，均經(jīng)本院中藥所鑒定為鐵皮石斛的干燥莖。

1.3 主要試劑 環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號：04150102)，碳酸鈉(廣東光華科技股份有限公司，批號：20150415)，甲醇(色譜純，天津市四友精細化學(xué)品有限公司，批號：150515)，乙腈(色譜純，德國默克公司，批號：JA034130)。

1.4 實驗動物 6周齡昆明種小鼠100只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號：SCXK桂2014-0002)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于無特定病原體級實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵皮石斛水提取物及醇提取物的制備 將鐵皮石斛粉碎為24目顆粒，加水(或乙醇)浸泡1 h，煎煮(或回流加熱)提取，1 h/次，共3次，合并提取液，過濾、濃縮、干燥成粉末，即得水(或醇)提取物。

2.2 供試品溶液的配制 精密稱取鐵皮石斛水(或醇)提取物適量，加50%甲醇(或100%甲醇)25 mL，稱定重量，回流加熱(或超聲處理，處理參數(shù)240 W、40 kHz、40℃)30 min，冷卻，用50%甲醇(或100%甲醇)補足重量，搖勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液濾過，濾液即為供試品溶液。

2.3 藥效實驗樣品配制 稱取水(或醇)提取物，蒸餾水溶解，配制成所需濃度。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件：色譜柱均為Shim-pack VP-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。(1)水提取物：流動相為甲醇(A)-水(B)。梯度洗脫：0～10 min,5%～12% A；10～30 min,12%～23% A；30～50 min,23%～5% A。體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10 μL；檢測波長為254 nm，柱溫為25℃。(2)醇提取物：流動相為乙腈(A)-水(B)。梯度洗脫：0～10 min,8%～15% A；10～38 min,15%～28% A；38～50 min,28%～20% A；50～65 min,20%～8% A。體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10 μL；檢測波長為310 nm，柱溫為30℃。

2.4.2 方法學(xué)考察：依據(jù)《中華人民共和國藥典(2015年版四部)》[4]規(guī)定的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察實驗方法學(xué)，指紋圖譜相似度的相對標準偏差均小于2.2%，符合藥物分析要求。

2.4.3 HPLC指紋圖譜：按上述的色譜條件開展實驗，記錄50～65 min HPLC圖；應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.130723版本)軟件(時間窗為0.4，生成的色譜方法為平均值)，多點校正色譜峰后進行匹配，形成各供試品的HPLC指紋圖譜。對各供試品各色譜峰的響應(yīng)值進行綜合，將具有3個以上的共有峰或2個響應(yīng)值較大的共有峰作為特征色譜峰；并將各供試品進樣量換算成mg生藥量，校正各特征色譜峰的峰面積，無色譜峰的對應(yīng)峰面積為0，共提取出30個特征色譜峰，見表1。

表1 各樣本色譜峰對應(yīng)的校正峰相對面積

2.5 鐵皮石斛對免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響 將100只小鼠按隨機區(qū)組法分為正常組、模型組及8個樣品組，每組10只，按照文獻[5]的方法進行實驗。各樣品組按1.633 g生藥/kg對小鼠進行灌胃給藥，正常組、模型組小鼠分別給予蒸餾水0.2 mL/10 g灌胃，1次/d，共10 d。除正常組外，其余各組小鼠分別于第3、7 d腹腔注射50 mg/kg環(huán)磷酰胺。末次給藥后1.5 h，各小鼠尾靜脈注射20%印度墨汁(生理鹽水稀釋)0.1 mL/10 g，注射后1 min(t1)及7 min(t2)，分別眼眶取血20 μL，溶于2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中，搖勻，酶標儀測定各血樣680 nm處的吸光度A值，計算廓清指數(shù)，廓清指數(shù)=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)，其中A1、A2分別為對應(yīng)時間血樣的680 nm處的吸光度A值。結(jié)果顯示，模型組的廓清指數(shù)低于正常組(P<0.05)；與模型組比較，各水提取物樣品組小鼠的廓清指數(shù)升高(均P<0.05)，但各醇提取物樣品組小鼠的炭末廓清指數(shù)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表2 8組小鼠廓清指數(shù)比較(n=10，x±s)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.6 譜效分析 按照文獻[6]方法開展炭末廊清指數(shù)與色譜峰間的譜效分析。廓清指數(shù)按(各提取物組-模型組)/(正常對照組-模型組)×100%進行預(yù)處理。以預(yù)處理后的廓清指數(shù)作為因變量Y，各供試品特征峰的峰面積作為自變量X，采用SIMCA-P 13.0軟件的PLSR進行譜效分析。經(jīng)軟件PLSR擬合，該模型標準化數(shù)據(jù)回歸方程為Y=(-3.78X1+4.21X2-2.61X3+5.91X4-4.74X5+5.91X6-9.82X7+5.61X8-3.80X9+6X10+1.73X11-1.62X12+6.12X13+5.62X14+5.21X15+3.85X16+5.75X17+5.49X18+4.4X19-3.2X20+6.72X21-3.48X22+5.45X23+1.17X24-0.73X25-2.44X26+4.84X27+4.21X28+0.4X29-3.53X30)×0.01 ，經(jīng)交叉驗證方差分析,該譜效關(guān)系PLSR分析模型有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3；X相對于Y有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的回歸系數(shù)有21個色譜峰，見圖1。其中可增強巨噬細胞吞噬功能的色譜峰為第4、6、8、10、11、14、15、17、18、21、23、27號，共12個。色譜峰UV標準化峰面積相對于廓清指數(shù)的相關(guān)系數(shù)見表4。

表3 色譜峰與廓清指數(shù)PLSR模型的相關(guān)系數(shù)

圖1 單位方差標準化色譜峰面積對廓清指數(shù)提高率的回歸系數(shù)及其95% CI

表4 色譜峰UV標準化峰面積相對于廓清指數(shù)的相關(guān)系數(shù)

3 討 論

中藥的藥效是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，某些化學(xué)成分與其藥效間存在著必然且緊密的聯(lián)系。PLSR是一種有廣泛適用性的多元統(tǒng)計方法，綜合了典型相關(guān)分析、主成分分析及多元線性回歸分析等多種統(tǒng)計分析的功能，可統(tǒng)計分析出因變量與自變量間的相關(guān)性、貢獻度，從而揭示中藥化學(xué)成分對藥效指標的綜合作用，近年來常被應(yīng)用于中藥譜效關(guān)系研究。本研究采用PLSR分析鐵皮石斛的提取物與免疫低下小鼠單核巨噬細胞吞噬功能間的譜效關(guān)系，模型回歸系數(shù)的絕對值反映了色譜峰所代表物質(zhì)對廓清指數(shù)影響的貢獻強弱。該模型提取的兩個主成分對自變量X解釋能力(R2X)達到72.8%，對因變量Y的解釋能力(R2Y)和預(yù)測能力(Q2)分別達到99.3%和96.8%，表明PLSR模型有良好的解釋和預(yù)測作用。

廓清指數(shù)PLSR模型的正數(shù)回歸系數(shù)中具有統(tǒng)計學(xué)意義的有12個色譜峰，其中10個來源于水提取物，X13和X21色譜峰同時來源于水提物、醇提物，但水提物的色譜峰面積分別為醇提取物的15.79、9.10倍，由此可推斷，可增強機體單核巨噬細胞吞噬功能的鐵皮石斛化學(xué)成分主要存在于水提取物中，其色譜峰分別為X4、X6、X8、X10、X13、X14、X15、X17、X18、X21、X23、X27。經(jīng)SPSS 23.0分析，X4、X8、X13等3個色譜峰UV標準化峰面積相對于Y的相關(guān)系數(shù)分別為0.953、0.919、0.931，具有極強相關(guān)性；X10、X14、X15、X18、X21、X23等6個色譜峰UV標準化峰面積相對于Y的相關(guān)系數(shù)分別為0.848、0.873、0.823、0.875、0.888、0.898，具有強相關(guān)性；其余3個色譜峰UV標準化峰面積相對于Y的偏相關(guān)系數(shù)在0.7～0.8之間，具有較強相關(guān)性。

模型擬合方程的負數(shù)回歸系數(shù)中具有統(tǒng)計學(xué)意義的有9個色譜峰，均來源于醇提取物，由此推斷，抑制機體單核巨噬細胞吞噬功能的鐵皮石斛化學(xué)成分主要存在于醇提取物中，其色譜峰分別為X1、X3、X5、X7、X9、X20、X22、X26、X30。因鐵皮石斛化學(xué)成分類別眾多、成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，這些色譜峰，尤其是可增強機體單核巨噬細胞吞噬功能的色譜峰，所對應(yīng)的具體化學(xué)成分有待進一步研究確定。