宗國(guó)霞 王威 夏宇躍 朱麗陽 區(qū)宇潔 林炳耀

廣東省佛山市第四人民醫(yī)院1婦科，2檢驗(yàn)科，4藥劑科（廣東佛山528000）；3廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心（廣州510330）

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40歲之前由各種原因?qū)е碌穆殉补δ芴崆八ソ?，其?dǎo)致患者閉經(jīng)提前，血清的卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素水平降低的一種綜合征［1］。目前對(duì)于POI其發(fā)病機(jī)制并未明確。研究［2］發(fā)現(xiàn)，POI患者其外周血中存在多種T細(xì)胞亞群的改變。人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是由HLA基因復(fù)合體所編碼的產(chǎn)物，其在免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［3］。HLA-DR表達(dá)于多種淋巴細(xì)胞中，其中細(xì)胞表明HLA-DR陽性的T淋巴細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞活化的重要標(biāo)志。POI患者卵巢組織顆粒細(xì)胞中HLA-DR抗原異常表達(dá)［4］，但對(duì)于POI患者中外周血中T細(xì)胞的HLA-DR表達(dá)水平仍缺乏研究。本研究旨在探討早發(fā)性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR細(xì)胞的表達(dá)水平，并分析其與自身免疫及卵巢儲(chǔ)備功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料選取于2017年3月至2018年10月于我院就診的早發(fā)性卵巢功能不全患者共63例（POI組），納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合早發(fā)性卵巢功能不全的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；（2）排除盆腔占位性病變；（3）排除盆腔炎癥；（4）獲得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）因卵巢手術(shù)、化療所致的卵巢衰竭；（2）合并免疫性疾病；（3）1個(gè)月內(nèi)服用過激素、免疫抑制劑及其他抗腫瘤藥物。選擇于我院體檢同期健康育齡女性（對(duì)照組）各例作為對(duì)照。健康育齡女性的納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜40歲，月經(jīng)正常，無盆腔占位病變或其它惡性腫瘤，無合并婦科炎癥或合并其它代謝、免疫性疾病。兩組患者的同質(zhì)性良好（表1）。

表1 兩組患者的一般資料Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients ±s

表1 兩組患者的一般資料Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients ±s

組別POI組對(duì)照組χ2/t值P值例數(shù)63 40年齡（歲）30.6±3.4 29.4±3.5 1.726 0.087初潮年齡（歲）13.7±1.7 13.6±1.9 0.278 0.782 BMI(kg/m2)22.3±2.0 21.9±1.6 1.066 0.289孕次（次）0.9±0.4 0.8±0.5 1.121 0.265

1.2檢測(cè)指標(biāo)和方法（1）記錄兩組女性的一般資料，包括年齡、初潮年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI），記錄POI患者的病程時(shí)間。（2）CD3+HLA-DR細(xì)胞和相關(guān)免疫細(xì)胞檢查：清晨空腹抽靜脈血5 mL，離心分離外周血的淋巴細(xì)胞備測(cè)。采用PE-conjugated anti-HLA-DR和FITC-anti-CD3的同型單克隆抗體進(jìn)行孵育，采用美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+HLA-DR抗原淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平。采用同樣的方法檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、的T細(xì)胞亞群，記錄CD4+/CD8+的比例，相關(guān)試劑由廣州金域檢驗(yàn)公司提供。（3）采用羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)性激素六項(xiàng)［FSH、LH、T、P、E2和PRL、抗苗勒管激素（AMH）、抑制素A（INHA）、抑制素B（INHB）］的含量，相關(guān)試劑由廣州金域檢驗(yàn)公司提供。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，兩指標(biāo)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者的外周血CD3+HLA-DR細(xì)胞表達(dá)對(duì)比POI組的外周血CD3+HLA-DR細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 兩組的外周血CD3+HLA-DR細(xì)胞表達(dá)對(duì)比Fig.1 Comparison of peripheral blood CD3+HLA-DR cells expression between the two groups

2.2兩組的免疫相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)水平POI組外周血的CD3+和CD8+細(xì)胞表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而CD4+以及CD4+/CD8+的水平顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3兩組的性激素和卵巢儲(chǔ)備功能指標(biāo)對(duì)比POI組性激素中的FSH、LH水平顯著高于對(duì)照組，而T、P、E2和PRL顯著低于對(duì)照組（P＜0.001）。而POI組的AMH、INHA和INHB水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.001）。見表3。

表2 兩組免疫相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)水平對(duì)比Tab.2 Comparison of expression levels of two groups of immune-related cells ±s

表2 兩組免疫相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)水平對(duì)比Tab.2 Comparison of expression levels of two groups of immune-related cells ±s

組別POI組對(duì)照組t值P值例數(shù)63 40 CD3+（%）73.6±5.7 68.2±8.4 3.888＜0.001 CD4+（%）32.9±3.6 38.8±5.2 6.804＜0.001 CD8+（%）34.7±4.3 25.4±4.6 10.412＜0.001 CD4+/CD8+0.947±0.142 1.536±0.235 15.870＜0.001

表3 兩組的性激素和卵巢儲(chǔ)備功能指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of sex hormone and ovarian reserve function indicators between the two groups of patients ±s

表3 兩組的性激素和卵巢儲(chǔ)備功能指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of sex hormone and ovarian reserve function indicators between the two groups of patients ±s

指標(biāo)FSH(U/L)LH(U/L)T(nmol/L)P(nmol/L)E2(pmol/L)PRL(ng/L)AMH（ng/mL）INHA（pg/mL）INHB（pg/mL）POI組（n=63）45.2±6.5 39.4±13.2 1.1±0.6 4.3±2.6 71.3±25.4 142.3±39.6 0.12±0.06 24.2±3.6 7.5±4.3對(duì)照組（n=40）14.2±7.4 18.5±9.6 1.7±0.5 16.5±6.8 376.8±87.2 252.4±63.8 5.3±2.2 37.3±10.4 53.6±17.7 t值22.347 8.659 5.267 12.864 26.178 10.818 18.731 9.189 19.823 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4POI患者外周血CD3+HLA-DR水平與各項(xiàng)指標(biāo)的關(guān)系POI中的外周血CD3+HLA-DR表達(dá)水平與CD3+、CD8+呈顯著的正相關(guān)，與CD4+和CD4+/CD8+的水平呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.001）；與性激素中的FSH、LH呈顯著的正相關(guān)（P＜0.001），與P和E2呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.001）；與卵巢存儲(chǔ)功能中的AMH、INHA和INHB水平均呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。見表4。

3 討論

POI與自然絕經(jīng)不同，因卵巢功能障礙，直接導(dǎo)致育齡女性的不孕癥［6］。POI最大特點(diǎn)是異常低水平的雌激素和高水平的FSH，這表明卵巢不再通過產(chǎn)生雌激素和發(fā)育受精卵來響應(yīng)循環(huán)FSH，卵巢進(jìn)而出現(xiàn)萎縮。研究［7］表明，免疫學(xué)機(jī)制在POI的病情進(jìn)展中具有重要的意義。由于目前仍缺乏有效的指標(biāo)預(yù)測(cè)病情的進(jìn)展，HLA-DR是MHC-II類分子，其主要表達(dá)于多種淋巴細(xì)胞上，對(duì)于T細(xì)胞中HLA-DR的表達(dá)表明T細(xì)胞存在激活狀態(tài)［8］，既往報(bào)道［4］顯示卵巢細(xì)胞中的HLA-DR抗原的異常表達(dá)可能參與了POI的病理過程，本研究也發(fā)現(xiàn)POI組患者的CD3+HLA-DR細(xì)胞比例顯著升高，與既往研究相符合，但POI患者外周血的CD3+HLA-DR細(xì)胞水平與自身免疫及卵巢存儲(chǔ)功能仍未明確。

表4 POI患者外周血CD3+HLA-DR表達(dá)水平與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of CD3+HLA-DR expression levels in peripheral blood of patients with POI and various indicators

本研究初步結(jié)果顯示了POI患者外周血的CD3+HLA-DR細(xì)胞水平顯著高于正常對(duì)照組的婦女，HLA-DR是發(fā)揮抗原呈遞作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子，因此外周血T細(xì)胞亞群的變化也反應(yīng)了POI患者機(jī)體內(nèi)存在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷［9］。POI患者中其外周血的CD4+以及CD4+/CD8+的水平顯著低于對(duì)照組，這也是反應(yīng)機(jī)體出現(xiàn)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷的重要表現(xiàn)。T細(xì)胞亞群中的輔助細(xì)胞和殺傷抑制細(xì)胞兩者比例失調(diào)后可導(dǎo)致機(jī)體免疫狀態(tài)抑制，POI患者其機(jī)體存在著細(xì)胞免疫功能紊亂的狀態(tài)。CD8+T細(xì)胞的分化和效能增加，促進(jìn)了卵巢誘發(fā)自身免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡，也加快了卵巢閉鎖。相關(guān)性分析的結(jié)果也顯示了CD3+HLA-DR細(xì)胞水平與CD3+、CD8+呈顯著的正相關(guān)，與 CD4+和 CD4+/CD8+的水平呈顯著的負(fù)相關(guān)，這表明了細(xì)胞機(jī)體內(nèi)的CD3+HLA-DR細(xì)胞水平能顯著反應(yīng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)。

POI組的卵巢儲(chǔ)備功能指標(biāo)中AMH、INHA和INHB水平均顯著低于對(duì)照組。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CD3+HLA-DR與卵巢存儲(chǔ)功能中的AMH、INHA和INHB水平均呈顯著的負(fù)相關(guān)。表明CD3+HLADR參與了調(diào)節(jié)了POI患者的性激素水平變化和影響了卵巢存儲(chǔ)功能。POI的基礎(chǔ)是由T細(xì)胞調(diào)節(jié)改變引起的細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)。其機(jī)制可能為活化狀態(tài)的T細(xì)胞加速了對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的免疫應(yīng)答，介導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞的損傷。AMH是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子中的一種亞型，在卵泡部位分泌并表達(dá)，對(duì)卵泡發(fā)育起至關(guān)重要的作用［10］，而INHA和INHB主要由卵巢顆粒細(xì)胞分泌，當(dāng)活化T細(xì)胞介導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞的損傷后，導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞AMH、INHA和INHB的減少。這就顯示了CD3+HLA-DR是調(diào)節(jié)卵巢儲(chǔ)備功能和性激素水平的重要T細(xì)胞亞群。對(duì)于T細(xì)胞活化介導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞損傷的機(jī)制仍需要進(jìn)一步需要細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)以驗(yàn)證POI患者外周血CD3+HLA-DR細(xì)胞水平與卵巢儲(chǔ)備功能的相關(guān)性。

本研究為單中心研究，仍需納入更多病例和指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。綜上所述，早發(fā)性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR細(xì)胞水平與自身免疫功能、性激素水平具有密切的關(guān)系，與卵巢存儲(chǔ)功能呈顯著的負(fù)相關(guān)。