任陳 李璐 徐艷俠 杜莎莎

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院放療科（廣州 510515）

放射治療是目前頭頸部腫瘤及中樞神經系統(tǒng)腫瘤的重要治療手段之一，患者在這一治療過程中不可避免地會出現(xiàn)放射性神經損傷。隨著診療手段的不斷進步及藥物研發(fā)水平的日益提高，腫瘤患者的預后及生存時間有了明顯改善，其海馬區(qū)域在放射治療過程中受到不同程度的照射，出現(xiàn)放射性神經損傷并導致生存質量下降［1-5］，這一現(xiàn)象得到了越來越多的關注［6-8］。如何減少放療患者的放射性神經損傷，成為了一個重要的臨床問題。

前期研究提示，丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA）可能通過調節(jié)糖酵解及自噬減輕海馬神經元放射性損傷［9］，且在動物試驗中也發(fā)現(xiàn)，其對經放射線照射后的豚鼠內耳毛細胞、血管紋及螺旋神經節(jié)均起到一定程度的保護作用［10］，但這一作用的具體機制尚不清楚。本文在前期研究的基礎上，發(fā)現(xiàn)糖酵解酶ALDOC在放射線聯(lián)合丹參酮ⅡA處理的神經元細胞中出現(xiàn)表達改變，并進一步研究相關調節(jié)通路，探索丹參酮ⅡA通過調節(jié)糖酵解減輕海馬神經元放射性損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞照射試驗分單純對照組（Control）；單純藥物組（Tan）；照射組（RT）；照射+丹參酮ⅡA處理組（RT+Tan）。采用本單位Varian 23EX直線加速器處理細胞，分別給予單次照射6 MV X射線，源皮距100 cm。

1.2熒光定量PCR檢測mRNA表達利用Trizol法提取各組細胞的總RNA，反轉錄試劑盒進行反轉錄（步驟主要參考TaKaRa反轉錄試劑盒說明書），實時熒光定量PCR檢測各組細胞Nrf2、ALDOC的mRNA表達水平。

1.3Western Blot檢測蛋白的表達水平在對數(shù)生長期收集細胞，D-hanks洗滌后加入RIPA裂解液裂解細胞，BSA法檢測蛋白濃度（方法同BSA試劑盒說明書），Western Blot檢測各組細胞糖酵解相關蛋白ALDOC、LDHA、Glut1，細胞自噬相關蛋白LC3、P62表達水平，以β-actin為內參。

1.4慢病毒系統(tǒng)構建ALDOC穩(wěn)定高表達及低表達HT-22細胞購買ALDOC過表達及干擾表達病毒液（上海吉凱公司），按照公司慢病毒感染說明書感染HT-22細胞，經G418處理后篩選出ALDOC過表達及沉默組細胞，分別為：LV-ALDOC，sh-ALDOC。

1.5MTT法檢測細胞活力在96孔板中分別接種 LV-Control、LV-ALDOC、sh-Control、sh-ALDOC，每種細胞設置3個復孔，細胞密度約5×103個/孔，細胞貼壁24 h后按照1.1方法照射，照射劑量為 10 Gy，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），4 h后小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值，分析各組細胞活力。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡6孔板中分別接種 LV-Control、LV-ALDOC、sh-Control、sh-ALDOC，細胞貼壁24 h后按照1.1方法照射，照射劑量為10 Gy，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，胰酶（EDTA Free）消化細胞，PE-Annexin-V/7-AAD雙染細胞，流式細胞儀檢測各組凋亡細胞比例。

1.7質粒轉染干擾Nrf2的表達培養(yǎng)HT-22細胞，轉染前1天細胞傳代至6孔板，細胞密度70%～80%，1 d后按照LipofectamineTM2000說明書轉染si-Nrf2、si-nc質粒（上海吉凱公司），48 h后收集細胞按照1.2、1.3方法提取RNA和蛋白質。

1.8免疫熒光檢測Nrf2的表達丹參酮ⅡA聯(lián)合放射線照射HT-22細胞后免疫熒光法檢測其Nrf2的表達。

1.9統(tǒng)計學方法使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用Bonferroni法（方差齊性），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1丹參酮ⅡA促進海馬神經元細胞株糖酵解相關酶ALDOC的表達對海馬神經元HT-22細胞加或不加丹參酮ⅡA處理，并予以放射線照射。相對于RT組，RT+Tan組HT-22細胞的糖酵解相關酶ALDOC在mRNA水平（F=97.488，P＜0.05，組內比較：RT vs.RT+Tan，P ＜ 0.05；圖1A）及蛋白水平（圖1B）表達明顯上調（P＜0.05）。

2.2ALDOC促進糖酵解及自噬調節(jié)海馬神經元放射性損傷利用慢病毒系統(tǒng)建立穩(wěn)定過表達ALDOC及穩(wěn)定沉默ALDOC細胞株。射線照射后分別檢測HT-22細胞的活力、細胞凋亡比例情況。結果顯示，ALDOC能顯著提高射線照射后海馬神經元HT-22細胞的存活率（F=126.13，P＜0.05）（圖2A），同時降低其凋亡比例（F=98.677，P＜0.05）（圖2B）。反之，穩(wěn)定干擾ALDOC能明顯抑制射線照射后HT-22細胞的細胞存活率（圖2A）。進一步檢測海馬神經元細胞HT-22的糖酵解及自噬水平，可見，ALDOC能增加經射線照射后的HT-22細胞糖酵解，且促進自噬相關蛋白的表達（圖2C）。

圖1 丹參酮ⅡA處理后海馬神經元HT-22細胞ALDOC表達情況Fig.1 ALDOC expression in hippocampal neurons HT-22 cells treated with tanshinoneⅡA

2.3丹參酮ⅡA通過Nrf2調控ALDOC的表達為進一步探討丹參酮ⅡA調節(jié)ALDOC的分子機制，利用PROMO、QIAGEN軟件分析與ALDOC啟動子區(qū)結合的轉錄因子，取二者交集，與文獻報道丹參酮ⅡA刺激后上調的轉錄因子再次做交集，發(fā)現(xiàn)Nrf2是ALDOC潛在的轉錄因子。經丹參酮ⅡA處理后，可見Nrf2及ALDOC在mRNA水平及蛋白水平表達均有明顯上調（P＜0.05）；隨后干擾Nrf2，ALDOC則隨之受到抑制（P ＜0.05，圖3A、3B）。且通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA處理HT-22細胞后，能上調Nrf2表達，并使Nrf2從細胞漿轉移至細胞核（圖3C）。

圖2 ALDOC對海馬神經元HT-22細胞的放射性損傷的作用Fig.2 Effect of ALDOC on radioactive damage of hippocampal neurons HT-22 cells

3 討論

本課題組在既往工作中發(fā)現(xiàn)，ALDOC可能在丹參酮ⅡA減輕海馬神經元放射性損傷過程中起到了關鍵的作用。ALDO是糖酵解過程中的一個重要的酶，對糖酵解的第4步這一可逆性的過程起到了催化作用。其家族有3個成員：ALDOA主要在肌肉中高表達，ALDOB常常在肝臟組織中發(fā)現(xiàn)，而ALDOC主要在腦海馬神經元及浦肯野神經元中表達［11］。有研究［12］表明ALDOC能與Wnt/βcatenin信號通路相互作用，從而影響細胞分化、大腦海馬回的發(fā)育等。當對丹參酮ⅡA處理后的海馬神經元HT-22細胞進行照射后，細胞的糖酵解相關酶以及自噬上調，生存分數(shù)較RT組明顯上升、凋亡減少，考慮丹參酮ⅡA可能通過誘導糖酵解及自噬而對海馬神經元起到保護作用，這一作用也在之前的研究中得到證實［9］。在這一過程中ALDOC也出現(xiàn)了明顯的表達上調。單純上調ALDOC也能明顯促進糖酵解相關酶和自噬的表達，細胞存活增加。而抑制丹參酮ⅡA處理后細胞的ALDOC，HT-22細胞在放射線照射后細胞凋亡比例較前增加，細胞糖酵解及自噬均明顯下降。表明丹參酮ⅡA可能是通過調節(jié)ALDOC的表達來保護海馬神經元放射性損傷。

Nrf2是機體內一個重要的內源性抗氧化因子，在細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、細胞生長和凋亡、炎癥反應以及泛素介導的降解等方面均有一定的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮能通過激活Nrf2，進一步活化其下游的細胞保護性因子GSH、SOD等，而拮抗神經毒素6-hydroxydopamine（6-OHDA）對SHSY5Y細胞線粒體的損傷，從而緩解帕金森病的進展［13-14］，在神經保護方面有著顯著作用。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能促進Nrf2的表達，同時促進其從胞漿到胞核的轉移，而生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，Nrf2作為重要轉錄因子與ALDOC的啟動子區(qū)結合，這可能是丹參酮ⅡA通過調控ALDOC的表達調節(jié)海馬神經元細胞放射性損傷的分子通路之一。

圖3 丹參酮ⅡA通過Nrf2促進ALDOC表達Fig.3 TanshinoneⅡA promotes ALDOC expression through Nrf2

自噬能產生降解產物，為生物合成提供底物，為細胞提供能量，具有重要的細胞代謝調節(jié)能力。當放射治療導致細胞能量供應缺乏時，為了維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞器的更新，給饑餓狀態(tài)下的細胞提供代謝底物以維持生存，包括神經元在內的大多數(shù)真核細胞能發(fā)生自噬［15-17］。大量信號通路與mTORC1相互作用，從而誘導自噬來抑制細胞生長并減少能量消耗，對抗應激狀態(tài)并存活［18-20］。自噬還能清除體內過多的過氧化物酶，防止其造成組織損傷，是生存的重要保守功能。丹參酮ⅡA則正可能是通過促進放射線照射的海馬神經元細胞糖酵解及自噬的增加，一方面減少能量消耗，另一方面通過糖酵解提供適量的能量，從而保障細胞的基本生長需求，起到放射性損傷的保護作用。

丹參酮ⅡA可能通過多種分子信號通路影響海馬神經元的存活，本研究僅在體外試驗細胞層面上初步探索了該藥物可能通過Nrf2調節(jié)糖酵解酶ALDOC從而引起糖酵解及自噬的改變，促進海馬神經元HT-22細胞對放射性損傷的耐受的相關機制，其在臨床治療過程中的應用尚有待于進一步探索。