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        568例HER2不確定乳腺癌原位雜交結(jié)果分析

        2019-08-01 06:17:22蔣依娜王博周燦王鴻雁
        腫瘤防治研究 2019年7期
        關(guān)鍵詞:乳腺癌檢測

        蔣依娜,王博,周燦,王鴻雁

        0 引言

        編碼HER2蛋白的人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor, HER2)基因位于17號染色體。HER2基因擴增與腫瘤的侵襲性增強和預(yù)后不良相關(guān),約15%~20%的乳腺癌患者存在HER2基因擴增[1]。曲妥珠單抗(Herceptin,赫賽?。┦轻槍ER2基因擴增患者的單克隆抗體,作為一線藥物,與紫杉類藥物聯(lián)合應(yīng)用能延長轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的生存期,提高患者生存質(zhì)量,單藥應(yīng)用也能起到治療作用[2-3]。新藥如拉帕替尼、帕妥珠單抗[4]等也逐漸被用于臨床。準(zhǔn)確判定HER2基因狀態(tài)是患者篩選和療效預(yù)測的前提。

        對于免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)為2+的HER2不確定病例,ASCO/CAP乳腺癌HER2檢測指南推薦使用原位雜交(in situ hybridization, ISH)法進一步檢測HER2基因擴增狀態(tài)。熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization, FISH)檢測結(jié)果準(zhǔn)確,在臨床應(yīng)用最為廣泛。雙色銀增強原位雜交(dual-color silver enhanced in-situ hybridization, DISH)因其亮視野的優(yōu)勢也逐漸應(yīng)用于HER2基因狀態(tài)評估。對于ISH結(jié)果判定,2018版[5]HER2檢測指南與2013版[1]相比,取消了HER2“不確定”的診斷名稱,將雙探針I(yè)SH的HER2檢測結(jié)果分為5組,且更強調(diào)HER2/CEPl7的重要,旨在進一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,指導(dǎo)臨床用藥。本研究分別采用2013版及2018版ASCO/CAP指南標(biāo)準(zhǔn),對568例免疫組織化學(xué)HER2不確定浸潤性乳腺癌組織的FISH結(jié)果進行對比分析,并隨機抽取60例進行DISH檢測,比較FISH及DISH檢測結(jié)果差異。

        1 資料與方法

        1.1 標(biāo)本處理

        收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2013—2017年手術(shù)切除診斷為浸潤性乳腺癌的標(biāo)本568例。標(biāo)本采用4%中性甲醛固定液切開固定6~24 h,標(biāo)準(zhǔn)化取材,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片。

        1.2 IHC檢測

        采用HER2(4B5,兔單克隆抗體,Ventana公司,瑞士)抗體、ultra View Universal DAB(Ventana公司,瑞士)檢測試劑盒及Ventana BenchMark XT(羅氏公司,瑞士)全自動切片染色機。所有病例均設(shè)有陽性對照,由2位病理醫(yī)生判讀,結(jié)果均為2+。

        1.3 FISH檢測

        所有病例均進行HER2雙探針FISH檢測,并按2013版及2018版ASCO/CAP乳腺癌HER2檢測指南標(biāo)準(zhǔn)分別判讀。所用PathVysion HER2 DNA、第17號染色體著絲粒(CEP17)雙熒光探針試劑盒、蛋白酶緩沖液、橡膠水泥等均購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。石蠟切片56℃烤片過夜、常規(guī)脫蠟、蛋白酶消化、乙醇脫水,取10 μl探針混合液加蓋玻片、橡膠水泥封片,75℃變性10 min后在雜交儀(美國Abbott StatSpin ThermoBrite公司)內(nèi)37℃雜交過夜(15~17 h)。次日洗片后二脒基苯基吲哚(DAPI)染色,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,VideoTest軟件進行圖像合成。

        1.4 DISH檢測

        隨機抽取60例進行DISH檢測并評估HER2基因擴增狀態(tài)。全過程包括脫蠟、修復(fù)、酶消化、探針雜交、顯色等,均在BenchMark XT全自動切片染色機內(nèi)進行。采用試劑購自羅氏公司,包括HER2/CEP17號染色體DNA雙探針、清洗緩沖液、銀染原位雜交DNP染色液及原位雜交地高辛紅染染色液及銀染清洗緩沖液。操作步驟及參數(shù)設(shè)置按照操作手冊及試劑說明書。常規(guī)封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

        1.5 判讀標(biāo)準(zhǔn)

        分別采用2013版及2018版ASCO/CAP乳腺癌HER2原位雜交判讀標(biāo)準(zhǔn), FISH與DISH檢測判讀標(biāo)準(zhǔn)相同,判讀至少2個浸潤性癌區(qū)域,隨機選擇20個腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞核大小一致且邊界完整、無重疊、信號清楚。結(jié)果不一致的病例,由第三位高年資病理醫(yī)生參與共同閱片,確定最終結(jié)果。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,對于不同標(biāo)準(zhǔn)下的檢測結(jié)果行配對t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。FISH與DISH兩種檢測結(jié)果的相關(guān)性,通過Pearson相關(guān)性分析進行檢測。

        2 結(jié)果

        2.1 FISH檢測結(jié)果

        568例浸潤性乳腺癌均為IHC檢測不確定標(biāo)本,男6例,女562例,平均年齡51.3歲(24~85歲),依據(jù)2013版ASCO/CAP指南分為:HER2陽性183例(183/568, 32.22%)、陰性365例(365/568, 64.26%)、不確定20例(20/568,3.52%);在陽性病例中,HER2/CEP17≥2.0者170例(170/183, 92.90%),HER2/CEP17<2.0者13例(13/183, 7.10%)。 依據(jù)2018版 ASCO/CAP HER2檢測指南分為:HER2陽性157例(157/568,27.64%)、陰性365例(365/568, 64.26%)、需進一步檢測HER2狀態(tài)46例(46/568, 8.10%),其中第二、三組均為13例(2.29%),第四組20例(3.52%),見表1。

        2.2 新舊版HER2指南變化

        表1 568例免疫組織化學(xué)不確定的浸潤性乳腺癌HER2 FISH檢測結(jié)果Table1 FISH results of HER2 in 568 cases of immunohistochemical HER2 equivocal invasive breast cancer

        采用2018版標(biāo)準(zhǔn)后,在未進行進一步IHC或ISH 計數(shù)的前提下,HER2陽性率減少了4.58%,陰性率無差異,需進一步檢測HER2基因狀態(tài)的病例增加了4.58%,兩種診斷標(biāo)準(zhǔn)相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。

        2.3 FISH和DISH檢測結(jié)果比較

        在FISH檢測的568例浸潤性乳腺癌患者中,隨機抽取60例進行DISH檢測,兩種檢測方法比較結(jié)果,見表2。

        表2 FISH和DISH方法檢測HER2基因狀態(tài)的比較Table2 Comparison of HER2 gene status between FISH and DISH test

        按2013版ASCO/CAP檢測指南對60例浸潤性乳腺癌HER2基因擴增狀態(tài)的FISH和DISH檢測結(jié)果比較顯示,兩者總符合率為95.0%(57/60),其中19例FISH陽性病例中DISH陽性18例(圖1)、DISH為不確定1例,陽性符合率為94.7%;3例FISH不確定病例(圖2A、3A),DISH不確定1例(圖2B)、陰性2例(圖3B),符合比例為33.3%;38例FISH陰性病例中DISH均為陰性,陰性符合率為100.0%。

        FISH方法檢測結(jié)果中HER2/CEP17比值范圍為0.9~10.0,中位數(shù)為1.4,DISH方法檢測結(jié)果中HER2/CEP17比值范圍為0.7~12.5,中位數(shù)為2.4,通過Pearson相關(guān)性分析,兩種方法的檢測結(jié)果顯著相關(guān)(r=0.636, P<0.01)。

        圖2 HER2基因擴增不確定的浸潤性乳腺癌Figure2 HER2 equivocal invasive breast cancer specimen tested by FISH and DISH

        圖3 FISH與DISH檢測結(jié)果不一致病例Figure3 Inconsistent case tested by FISH and DISH

        3 討論

        1987年Slamon第一次提出HER2基因在乳腺癌生物學(xué)行為和腫瘤發(fā)生方面具有重要的意義[6]。2000年,針對HER2基因擴增的單克隆抗體曲妥珠單抗在歐洲注冊并用于治療HER2陽性乳腺癌患者,據(jù)報道該小分子抑制劑可減少50%復(fù)發(fā)率及約30%的死亡率[7-8]。目前,已有四種HER2靶向藥物被批準(zhǔn)用于臨床,曲妥珠單抗、拉帕替尼、帕妥珠單抗及ado-曲妥珠單抗emtansine[9]。HER2基因狀態(tài)的準(zhǔn)確評估,對于HER2基因擴增乳腺癌患者的篩選、臨床用藥選擇及患者預(yù)后至關(guān)重要。

        2007年ASCO/CAP首次推薦乳腺癌HER2檢測指南[10]作為臨床及病理醫(yī)生判讀評估乳腺癌患者HER2基因狀態(tài)的依據(jù),旨在減少假陽性病例診斷,避免HER2靶向治療藥物過度使用而產(chǎn)生的不良反應(yīng)及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。該指南于2013年更新[1]。2018年7月,根據(jù)文獻(xiàn)回顧及真實世界研究數(shù)據(jù)分析,ASCO/CAP發(fā)表了最新版HER2檢測指南[5],與前幾版相比,該指南判讀標(biāo)準(zhǔn)更明確、分類更精細(xì)。變動主要包括以下幾方面:第一,將HER2 IHC 2+的定義由弱至中等強度的不完整細(xì)胞膜著色,更改為完整細(xì)胞膜著色。從而減少了IHC不確定病例的數(shù)量;第二,對于初診為HER2陰性的穿刺標(biāo)本,不再強調(diào)術(shù)后必須重復(fù)進行HER2狀態(tài)檢測。認(rèn)為穿刺與手術(shù)切除標(biāo)本具有較高的一致性;第三,取消了HER2“不確定”的診斷名稱,將雙探針I(yè)SH的HER2檢測結(jié)果分為5組,對于爭議比較大的2、3、4組,建議聯(lián)合IHC和ISH的檢測結(jié)果綜合判讀。本研究同時進行IHC、FISH和DISH的60例樣本中,3例為FISH不確定,屬于第4組,即HER2/CEP17<2.0,HER2平均拷貝數(shù)≥4且<6,根據(jù)2018版指南要求,重新進行IHC結(jié)果為2+,隨后進行第二種原位雜交方法DISH檢測,陰性2例,不確定1例,該不確定病例按照2013版指南應(yīng)診斷為HER2不確定,但是根據(jù)2018版指南,則應(yīng)診斷為HER2陰性。我們認(rèn)為,和前幾版相比,2018版指南減少了病理醫(yī)生診斷方面的困惑,特別是取消了“HER2不確定”的診斷名稱,對臨床用藥更具指導(dǎo)作用。

        許多學(xué)者認(rèn)為,相對于HER2/CEP17比值而言, HER2基因拷貝數(shù)目更為重要。Varga等[11]研究發(fā)現(xiàn), HER2基因擴增常常伴隨著絲粒區(qū)的擴增, 如果不強調(diào)HER2基因拷貝數(shù),會導(dǎo)致HER2/CEPl7<2.0的假陰性結(jié)果。另一方面,對于HER2/CEP17≥2.0且HER2拷貝數(shù)<4的病例,根據(jù)2013版指南,應(yīng)判讀為HER2基因擴增,但實際是否存在擴增,專家之間意見尚未統(tǒng)一,有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)是CEP17拷貝數(shù)過低造成的假陽性結(jié)果。這部分陽性病例需更進一步的隨訪。本研究中13例(2.29%)可歸為此類,目前相關(guān)的用藥療效統(tǒng)計仍在進行中。

        目前,臨床主要使用IHC法檢測HER2蛋白的表達(dá)水平,采用ISH法檢測HER2基因的擴增水平。我國乳腺癌HER2檢測指南推薦以上兩種方法相結(jié)合的檢測策略[12]。在建立完善的實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作程序及使用標(biāo)準(zhǔn)化檢測試劑等前提下,IHC以其費用低、操作簡便等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于臨床。雖然,IHC僅能檢測HER2蛋白表達(dá)水平,但是仍可以準(zhǔn)確評估HER2狀態(tài)。Hanna等研究發(fā)現(xiàn),對于手術(shù)切除標(biāo)本情況為0~1+的病例,與ISH相比,IHC僅存在0.84%的假陰性誤差[13]。雙探針FISH自1998年獲得FDA批準(zhǔn)以來,因其準(zhǔn)確客觀的優(yōu)點,一直作為檢測HER2基因狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”被廣泛應(yīng)用[14]。但FISH需全程避光并且需要配備熒光顯微鏡觀察信號,熒光易淬滅、切片不易長期保存。2008年,顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization, CISH)經(jīng) FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。作為亮視野下的原位雜交,該項技術(shù)由Tanner等首先引入乳腺癌HER2檢測[15]。但CISH不含17號染色體著絲粒探針,所以不能準(zhǔn)確判斷17號染色體多體的狀態(tài),對HER2多倍體的病例判讀時會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。DISH技術(shù)是一種能夠同時檢測到HER2基因和17號染色體著絲粒的亮視野原位雜交技術(shù),可實現(xiàn)全自動操作,耗時短,無需避光,普通光學(xué)顯微鏡可觀察結(jié)果,信號清晰,切片可長期保存,于2012年通過FDA認(rèn)證[16],2014年獲得我國乳腺癌HER2檢測指南推薦應(yīng)用臨床[14]。對照研究發(fā)現(xiàn),DISH技術(shù)與FISH和CISH符合率為94%~99%[17]。更有研究發(fā)現(xiàn),在使用原位雜交技術(shù)檢測浸潤性乳腺癌中TOP2A基因狀態(tài)時,DISH較FISH更具優(yōu)勢[18]。Lim等的對比研究證明DISH與FISH相比,檢測符合率高,且用時短[16]。根據(jù)實驗室2年統(tǒng)計,DISH耗時僅為FISH檢測的1/2~1/3。

        我們隨機抽取60例患者進行DISH檢測,與FISH檢測的總體符合率為95.0%,其中陽性符合率為94.7% ,陰性符合率為100% 。DISH與FISH檢測結(jié)果的不一致性主要表現(xiàn)為陽性病例的減少和不確定病例的增加。判讀有差別的病例分析原因,主要有以下兩點:(1)DISH判讀標(biāo)準(zhǔn)中,黑色重疊信號計數(shù)為 1 個,低拷貝或CEP17多體時,易判讀為陰性結(jié)果;(2)計數(shù)區(qū)域選擇不同,乳腺癌異質(zhì)性較高,人為選擇計數(shù)區(qū)域會有差異,造成可能的判讀結(jié)果不同。所以,進行DISH檢測時,應(yīng)根據(jù)各實驗室的實際條件,選擇最佳條件,減少誤差。并加強人員標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn),選擇合適的區(qū)域進行計數(shù),在判讀黑色重疊信號時,應(yīng)用最科學(xué)準(zhǔn)確的方法。

        綜上所述, 2018版指南取消“HER2不確定”診斷名稱,判讀標(biāo)準(zhǔn)更明確,對于準(zhǔn)確判讀HER2基因狀態(tài)、臨床用藥等方面更具指導(dǎo)作用。HER2基因的染色體多體性在乳腺癌中少見,因此判讀結(jié)果時HER2/CEP17比值與CEP17拷貝數(shù)同樣重要。但是,對于HER2/CEP17比值≥2.0,CEP17拷貝數(shù)<4的病例實際是否存在HER2基因擴增還需深入研究。在臨床應(yīng)用中,檢測浸潤性乳腺癌患者HER2狀態(tài),IHC、FISH和DISH三種方法相輔相成,各具優(yōu)缺點。雖然DISH技術(shù)具有FISH和CISH缺乏的顯著優(yōu)點,并且檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,但陽性率仍有待提高,應(yīng)結(jié)合各實驗室實際情況,優(yōu)化實驗條件,確保檢測準(zhǔn)確性。

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