韓娟，劉江，黃梅

0 引言

胃癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其病死率居所有惡性腫瘤的第二位[1-2]。其治療方法以手術(shù)為主并輔以化療的綜合治療為主。然而流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示其臨床治療效果并不盡如人意[3-4]。研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展基于多種基因的異常表達(dá)及調(diào)控，因此明確參與其中的靶基因的作用可能有助于提高胃癌的診治水平[5-6]。FBXL20是新近發(fā)現(xiàn)的泛素連接酶Skp1-Cullin1-F-box復(fù)合體中的重要組成成分，它通過(guò)泛素化降解靶分子從而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXL20參與了結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、喉癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過(guò)程[10-14]，然而其在胃癌中的表達(dá)、作用和機(jī)制仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在檢測(cè)FBXL20在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，并探討其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制，以期為胃癌的診斷及治療提供一個(gè)新的基因靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1及3株人胃癌細(xì)胞系（BGC-823、AGS、MKN-45）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。兔抗人FBXL20多克隆抗體、兔抗人GSK-3β單克隆抗體、兔抗人p-GSK-3βTyr216多克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人Cyclin D1多克隆抗體、小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。小鼠抗人p-β-catenin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG二抗、CCK-8試劑盒、MG-132試劑均購(gòu)自上海碧云天公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞均采用RPMI1640培養(yǎng)基，配以10%胎牛血清、100 u/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒感染 含有FBXL20干擾載體的慢病毒及對(duì)照病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司。所用慢病毒載體采用pGLVH1/GFP+Puro載體，其中FBXL20-RNAi序列為：5’-ACTCCTGTTACGGATATTT-3’，Control-RNAi序列為：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。將2 ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞（5×105個(gè)）加入到6孔板，培養(yǎng)24 h后棄上清液，加入含有FBXL20干擾載體的慢病毒載體或?qū)φ詹《?，并加? μl的Polybrene以增強(qiáng)感染效果。感染48 h后更換含有5 μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基，篩選7天后得到穩(wěn)定抑制FBXL20表達(dá)的AGS細(xì)胞株（FBXL20-RNAi）及實(shí)驗(yàn)對(duì)照株（Control-RNAi）。

1.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除培養(yǎng)基后用預(yù)冷的PBS充分清洗3次。隨后加入RIPA裂解液對(duì)細(xì)胞冰上裂解30 min，離心取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定上清中蛋白濃度。采用10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，每個(gè)泳道蛋白上樣量為40 μg，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，然后分別加入FBXL20（1:1000稀釋）、GSK-3β（1:1 000稀釋）、p-GSK-3βTyr216（1:1 500稀釋）、β-catenin（1:1 000稀釋）、p-β-catenin（1:1 000稀釋）、Cyclin D1（1:1 000稀釋）、E-cadherin（1:1 500稀釋）及β-actin（1:1 500稀釋）抗體4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次后，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫?fù)u床孵育1 h，再用TBST洗膜3次, 每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，定影后進(jìn)行分析。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將FBXL20-RNAi組及Control-RNAi組的AGS細(xì)胞接種于96孔板（5×103個(gè)/孔），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在種板后0、12、24、36、48 h分別在每孔中加入10 μl CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm處的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲 將FBXL20-RNAi組及Control-RNAi組的AGS細(xì)胞消化離心后，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至5×104/ml。將無(wú)Matrigel基質(zhì)膠和有Matrigel基質(zhì)膠的8 μm孔徑大小的Transwell小室放入24孔板中，分別用于完成遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。兩組實(shí)驗(yàn)都在小室上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入700 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕擦掉上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗2次。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)小室細(xì)胞的遷移數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用GraphPad Prism 6.0作圖。正態(tài)分布的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBXL20在胃黏膜上皮細(xì)胞系及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)

與人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（1.00±0.19）比較，胃癌細(xì)胞系BGC-823（1.79±0.15）、AGS（2.27±0.31）及MKN-45（2.11±0.17）中FBXL20的蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），見(jiàn)圖1。

2.2 慢病毒感染抑制AGS細(xì)胞中FBXL20的表達(dá)

通過(guò)慢病毒感染將包含抑制FBXL20的shRNA序列導(dǎo)入AGS細(xì)胞中，構(gòu)建了穩(wěn)定抑制FBXL20表達(dá)的細(xì)胞系。與對(duì)照組（Control-RNAi）（1.00±0.07）比較，抑制組（FBXL20-RNAi）中FBXL20的蛋白表達(dá)（0.28±0.11）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0053），見(jiàn)圖2。

圖1 人胃黏膜上皮細(xì)胞及3種胃癌細(xì)胞系中FBXL20的相對(duì)表達(dá)水平Figure1 Expression levels of FBXL20 in normal gastric epithelial cell line and three gastric cancer cell lines

2.3 抑制FBXL20的表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制FBXL20后AGS細(xì)胞在0、12、24、36、48 h的增殖情況。與Control-RNAi組（1.43±0.19）比較，F(xiàn)BXL20-RNAi組（0.78±0.16）的細(xì)胞增殖能力在48 h顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），見(jiàn)圖3。

2.4 抑制FBXL20的表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control-RNAi組（1.00±0.08）比較，F(xiàn)BXL20-RNAi組（0.63±0.15）相對(duì)遷移率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048），見(jiàn)圖4A。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control-RNAi組（1.00±0.11）比較，F(xiàn)BXL20-RNAi組（0.43±0.16）相對(duì)侵襲率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019），見(jiàn)圖4B。

2.5 FBXL20通過(guò)促進(jìn)GSK-3β的泛素化降解調(diào)控Wnt通路

圖2 FBXL20-RNAi慢病毒感染后AGS細(xì)胞中FBXL20表達(dá)水平Figure2 Expression level of FBXL20 in AGS cells after FBXL20-RNAi lentivirus infection

圖3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制FBXL20對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響Figure3 Effect of FBXL20 knockdown on proliferation of AGS cells detected by CCK-8 assay

圖4 Transwell檢測(cè)抑制FBXL20對(duì)AGS細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)的影響Figure4 Effect of FBXL20 knockdown on migration(A) and invasion(B) of AGS cells detected by transwell assay

Western blot結(jié)果顯示，抑制FBXL20后AGS細(xì)胞中GSK-3β、p-GSK-3βTyr216的表達(dá)增加，而β-catenin、p-β-catenin的表達(dá)降低，且受β-catenin調(diào)控的與增殖、遷移及侵襲功能密切相關(guān)的靶蛋白Cyclin D1及E-cadherin的表達(dá)也降低，見(jiàn)圖5A。為了進(jìn)一步驗(yàn)證FBXL20主要是通過(guò)促進(jìn)GSK-3β泛素化而調(diào)控Wnt通路，我們采用26S蛋白酶體抑制劑MG-132進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)MG-132能反轉(zhuǎn)FBXL20-RNAi對(duì)GSK-3β的調(diào)控作用，見(jiàn)圖5B，提示FBXL20可能泛素化調(diào)控Wnt通路。

圖5 Western blot檢測(cè)抑制FBXL20對(duì)Wnt通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure5 Effect of FBXL20 knockdown on expression of Wnt pathway-related proteins detected by Western blot

3 討論

胃癌雖然通過(guò)手術(shù)、化療等可以提高患者生存率，但胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致治療失敗的主要原因[15-16]。因此，深入研究引起復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素并進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)是目前胃癌研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

FBXL20屬于泛素連接酶F-box家族成員，該家族成員可構(gòu)成Skp1-Cullin1-F-box復(fù)合體，通過(guò)降解特定底物從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、周期進(jìn)程、凋亡等過(guò)程。研究表明，F(xiàn)BXL20在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并且通過(guò)介導(dǎo)E-cadherin的泛素化降解從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[17]。抑制FBXL20能調(diào)控食管癌中β-catenin信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯、抑制食管癌細(xì)胞遷移和侵襲[18]。然而在非小細(xì)胞肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，抑制FBXL20能促進(jìn)周期蛋白CDK1、Cyclin A、Cyclin B1的表達(dá)，加快G2/M期的進(jìn)程，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖[13]。這說(shuō)明FBXL20可能兼有抑癌基因和癌基因的雙重作用，其作用的發(fā)揮可能具有腫瘤類別依賴性，但是FBXL20在胃癌中的表達(dá)及作用還不清楚。本研究通過(guò)對(duì)3種胃癌細(xì)胞系中FBXL20蛋白水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)明顯升高。隨后抑制AGS細(xì)胞中FBXL20的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯降低。這些結(jié)果與以往食管癌、結(jié)腸癌的研究結(jié)果相一致，表明FBXL20在胃癌中可能發(fā)揮癌基因的作用。

有研究證實(shí)，Wnt信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[19-21]。GSK-3β作為Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，通過(guò)磷酸化β-catenin的氨基端，開(kāi)啟β-catenin的泛素降解[22-23]。β-catenin的降解使其不能有效與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Let結(jié)合，從而導(dǎo)致增殖、遷移等相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平降低[24-25]。多種F-box家族成員可以通過(guò)泛素化降解Wnt通路中的關(guān)鍵蛋白從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)進(jìn)程。如FBXO17能夠識(shí)別和介導(dǎo)GSK-3β的多泛素化降解，從而抑制肺癌細(xì)胞中炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生[26]。FBXW1能夠促進(jìn)β-catenin的泛素化降解，從而參與結(jié)直腸腫瘤的進(jìn)程[27]。有研究表明，F(xiàn)BXL20可能參與了食管癌中Wnt通路的調(diào)控[18]，因此我們預(yù)測(cè)FBXL20可能通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路從而參與了胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的進(jìn)程。通過(guò)MG-132抑制實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)抑制FBXL20能降低GSK-3β的泛素化降解，從而增加AGS細(xì)胞中GSK-3β、p-GSK-3βTyr216表達(dá)水平。而p-GSK-3βTyr216表達(dá)的增加加速了β-catenin的磷酸化，導(dǎo)致與增殖及遷移相關(guān)的靶蛋白Cyclin D1及E-cadherin表達(dá)水平的下降[27-28]。由此推測(cè)，F(xiàn)BXL20可能通過(guò)泛素化調(diào)控GSK-3β表達(dá)水平，從而有效控制胃癌細(xì)胞中Wnt通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，本研究表明FBXL20在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，且其通過(guò)促進(jìn)Wnt通路中GSK-3β的泛素化降解從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果為胃癌的診斷和靶向治療提供了一個(gè)新的思路。