袁源，趙千，胡占升

0 引言

乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性的生命健康，其死亡率也呈逐年上升的趨勢(shì)。目前，乳腺癌仍以手術(shù)治療為主，輔以放化療?；熢谌橄侔┑木C合治療中扮演著不可或缺的角色。阿霉素是乳腺癌化療的一線用藥，然而，阿霉素對(duì)非腫瘤組織的毒副作用尤其是心臟毒性常常會(huì)限制其臨床應(yīng)用[1]；同時(shí)，長(zhǎng)期化療也易使乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感度降低，導(dǎo)致化療效果不佳甚至失敗。因此，如何在提高阿霉素化療敏感度的同時(shí)降低其毒副作用成為研究熱點(diǎn)。丹參酮ⅡA是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的有效成分，不僅具有保護(hù)心血管系統(tǒng)以及肝臟和腎臟、調(diào)節(jié)免疫力等功能[2]，同時(shí)還具有抗腫瘤作用[3-6]。因此，我們選擇丹參酮ⅡA作為研究對(duì)象，研究其對(duì)人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞阿霉素化療敏感度的影響與可能機(jī)制，以期為丹參酮ⅡA作為化療增敏劑與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用治療乳腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMIl640購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于德國(guó)Serana公司；人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室友情饋贈(zèng)；阿霉素購(gòu)于深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司；丹參酮ⅡA（純度≥98%）購(gòu)于上海江萊生物科技公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京四正柏生物科技有限公司；CD24-PE和CD44-FITC抗體均購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司；GAPDH、P-gp、BCRP及MRP1抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 MTS法評(píng)估丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7及MDAMB-231細(xì)胞，調(diào)整密度至1×105個(gè)/毫升，按每孔100 μl的細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，次日用不同濃度的丹參酮ⅡA處理細(xì)胞24 h，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。最終選用對(duì)MCF-7及MDAMB-231細(xì)胞增殖沒(méi)有影響的無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA（沒(méi)有到有影響的臨界濃度）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖率=（OD實(shí)驗(yàn)組平均值-OD空白對(duì)照組平均值）/（OD陰性對(duì)照組平均值-OD空白對(duì)照組平均值）×100%。

1.2.2 MTS法評(píng)估無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/毫升，按每孔100 μl的細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，次日分別用不同濃度的阿霉素以及阿霉素聯(lián)合0.02 mg/L的丹參酮ⅡA處理MCF-7細(xì)胞；不同濃度的阿霉素以及阿霉素聯(lián)合0.6 mg/L的丹參酮ⅡA處理MDA-MB-231細(xì)胞。24 h后MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的凋亡 分別用2.0 μg/ml阿霉素、2.0 μg/ml阿霉素聯(lián)合0.02 mg/L的丹參酮ⅡA處理MCF-7細(xì)胞24 h；2.0 μg/ml阿霉素、2.0 μg/ml阿霉素聯(lián)合0.6 mg/L的丹參酮ⅡA處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h；以下實(shí)驗(yàn)方法相同。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后用1×Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/毫升，取100 μl的該細(xì)胞懸液，分別加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，混勻后室溫下避光孵育15 min，加入PBS至400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 流式細(xì)胞法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中CD44+/CD24-/low的表達(dá) 收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后重新懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/毫升，取100 μl的該細(xì)胞懸液，分別加入1 μl的CD44-FITC抗體和5 μl的CD24-PE抗體，混勻后4℃下避光孵育20 min，加入PBS至400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44+/CD24-/low的表達(dá)情況。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累的影響 PBS洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞，PBS重新懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/毫升，取500 μl該細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)阿霉素的積累情況。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞P-gp、BCRP、MRP1的表達(dá) 收集細(xì)胞，按試劑說(shuō)明書提取總蛋白并測(cè)定相應(yīng)蛋白的濃度。稀釋各蛋白濃度至相同的終濃度，取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉液封閉1 h，加入稀釋后的一抗GAPDH（1:1 000）、P-gp（1:500）、BCRP（1:500）、MRP1（1:500） 4℃下孵育過(guò)夜，次日加入稀釋后的二抗（1:500）室溫下孵育1 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯色，自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像，以目的蛋白與GAPDH的吸光度比值表示相對(duì)蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

丹參酮ⅡA能劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，其中，丹參酮ⅡA濃度不超過(guò)0.02 mg/L對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，而丹參酮ⅡA濃度不超過(guò)0.6 mg/L對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，見(jiàn)圖1A、B。因此，本研究中MCF-7細(xì)胞選用0.02 mg/L、MDA-MB-231選用0.6 mg/L的丹參酮ⅡA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與單用阿霉素相比較，阿霉素與無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用后MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的增殖率呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖1C、D。

圖1 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的MCF-7(A,C)及MDA-MB-231(B,D)細(xì)胞增殖的影響Figure1 Effects of tanshinoneⅡA intervention on proliferation of doxorubicin-treated MCF-7(A,C) and MDA-MB-231(B,D) cells

圖2 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的MCF-7(A,C)及MDA-MB-231細(xì)胞(B,D)凋亡的影響Figure2 Effects of tanshinone ⅡA intervention on apoptosis of doxorubicin-treated MCF-7(A,C)and MDA-MB-231(B,D) cells

2.2 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

單用阿霉素時(shí)，MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡率分別為（28.4±2.7）%、（26.5±4.2）%；阿霉素與無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用后，MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡率分別為（37.65±0.35）%、（42.9±3.6）%。與單用阿霉素相比較，阿霉素與無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用明顯提高了MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡率（MCF-7: P=0.021； MDA-MB-231:P=0.007），見(jiàn)圖2。

2.3 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的乳腺癌細(xì)胞CD44+/CD24-/low表達(dá)的影響

單用阿霉素時(shí)，MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞中CD44+/CD24-/low的表達(dá)分別為（20.9±10.9）%、（56.4±3.3）%；阿霉素與無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用后，MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞中CD44+/CD24-/low的表達(dá)分別為（17.7±10.3）%、（46.5±4.8）%。與單用阿霉素相比較，丹參酮ⅡA提高了阿霉素對(duì)人乳腺癌干細(xì)胞的殺傷作用，這種作用在MDA-MB-231細(xì)胞表現(xiàn)的更為明顯（MDAMB-231: P=0.048），見(jiàn)圖3。

2.4 阿霉素聯(lián)合丹參酮ⅡA干預(yù)前后乳腺癌細(xì)胞外排型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、BCRP及MRP1的表達(dá)變化

與單用阿霉素相比較，阿霉素與丹參酮ⅡA聯(lián)合處理的MCF-7及MCF-7/dox細(xì)胞外排型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、BCRP及MRP1的表達(dá)明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的MCF-7(A,C)及MDA-MB-231(B,D)細(xì)胞CD44+/CD24-/low表達(dá)的影響Figure3 Effect of tanshinone ⅡA intervention on expression of CD44+/CD24-/low in doxorubicin-treated MCF-7(A,C) and MDA-MB-231(B,D) cells

圖4 阿霉素聯(lián)合丹參酮ⅡA干預(yù)前后MCF-7(A)及MDA-MB-231(B)細(xì)胞外排型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、BCRP及MRP1的表達(dá)變化Figure4 Effect of tanshinone ⅡA intervention on expressions of P-gp, BCRP and MRP1 in doxorubicin-treated MCF-7(A)and MDA-MB-231(B) cells

2.5 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累的影響

單用阿霉素時(shí)，MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累分別為60.2±4.3、65±5.5；阿霉素與無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用后，MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累分別為76.7±4.9、80.3±8.1。在同樣濃度阿霉素處理的條件下，經(jīng)丹參酮ⅡA干預(yù)后的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累明顯增高（MCF-7: P=0.014； MDA-MB-231: P=0.042），見(jiàn)圖5。

3 討論

以往研究表明，不同作用機(jī)制的化療藥物在乳腺癌的治療中顯示出累加的藥效[7-8]，這意味著多種化療藥聯(lián)合治療乳腺癌要比一種化療藥單獨(dú)治療更有效。因此，臨床上多將阿霉素與一種或兩種化療藥物聯(lián)合用于治療乳腺癌。雖然這樣聯(lián)合用藥可以降低阿霉素的使用劑量，從而減輕其不良反應(yīng)，甚至一定程度彌補(bǔ)了由于阿霉素耐藥所引起的療效不佳的問(wèn)題，但也會(huì)因此增加其他化療藥物所帶來(lái)的不良反應(yīng)[9]。理想的與阿霉素聯(lián)合使用的藥物應(yīng)該在具備抗腫瘤作用的同時(shí)又具有對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。但是，臨床上鮮有這樣的藥物應(yīng)用。丹參酮ⅡA不僅具有抗腫瘤作用[3-6]，本研究將阿霉素與其聯(lián)合應(yīng)用，評(píng)估了其對(duì)阿霉素抗人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示：丹參酮ⅡA能劑量依賴性抑制MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的增殖；與單用阿霉素相比較，即使阿霉素與無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用，也能明顯增強(qiáng)阿霉素抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近年來(lái)研究顯示，乳腺癌干細(xì)胞與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、乳腺癌的耐藥密切相關(guān)，因此，乳腺癌干細(xì)胞被認(rèn)為是乳腺癌化療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。CD44+/CD24-/low被認(rèn)為是乳腺癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物[10]，我們通過(guò)檢測(cè)無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)阿霉素處理的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞CD44+/CD24-/low表達(dá)的影響來(lái)評(píng)估二者聯(lián)合用藥治療乳腺癌的效果。結(jié)果顯示，與單用阿霉素相比較，即使阿霉素與無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，也能明顯增強(qiáng)阿霉素殺死乳腺癌干細(xì)胞的能力。以上研究結(jié)果表明，丹參酮ⅡA能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素化療的敏感度。因此，我們對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

圖5 丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)MCF-7(A, C)及MDA-MB-231(B, D)細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累的影響Figure5 Effect of tanshinone ⅡA intervention on accumulation of doxorubicin in doxorubicin-treated MCF-7(A, C) and MDA-MB-231(B, D) cells

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是分布于細(xì)胞膜上的一個(gè)古老而龐大的蛋白家族，可通過(guò)調(diào)控藥物的攝取和排除，參與藥物在體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)化及排泄過(guò)程。按其轉(zhuǎn)運(yùn)方向的不同，可以分為攝取型轉(zhuǎn)運(yùn)體和外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體兩種。其中，外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠依賴ATP水解釋放的能量，將攝入細(xì)胞內(nèi)的阿霉素排除，從而導(dǎo)致阿霉素的療效降低，甚至發(fā)生阿霉素耐藥[11]。目前發(fā)現(xiàn)的與藥物敏感度相關(guān)的外排型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有9個(gè)，其中P-gp、BCRP和MRP1研究的最多，且結(jié)果顯示這三種蛋白的表達(dá)水平與阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的積累以及乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感度呈負(fù)相關(guān)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，即使無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA也能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞阿霉素化療的敏感度，因此，我們首先檢測(cè)了丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累的影響。結(jié)果顯示，在同一濃度阿霉素處理的條件下，無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA能明顯增加MCF-7及MCF-7/dox細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累的量。我們接下來(lái)評(píng)估了丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)MCF-7及MDAMB-231細(xì)胞P-gp、BCRP、MRP1的表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，無(wú)毒劑量的丹參酮ⅡA能明顯下調(diào)阿霉素處理的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞P-gp、BCRP、MRP1的表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，在同一濃度阿霉素處理的條件下，丹參酮ⅡA能夠通過(guò)下調(diào)P-gp、BCRP、MRP1的表達(dá)增加乳腺癌細(xì)胞內(nèi)阿霉素的積累，從而增加阿霉素在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的生物利用度，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞阿霉素化療的敏感度。因此，當(dāng)阿霉素與丹參酮ⅡA聯(lián)合使用時(shí)，既一定程度地降低阿霉素的給藥劑量，也能達(dá)到原有給藥劑量的化療效果，從而一定程度地降低阿霉素的毒副作用。以往研究表明，即使在同一濃度阿霉素處理的條件下，丹參酮ⅡA也能降低阿霉素的毒副作用[14]。因此，丹參酮ⅡA可以作為一種化療增敏劑與阿霉素聯(lián)用治療乳腺癌。