宮夢曉，鄧鑫州，沈力，張夢琳，柯青，吳林，劉艷芹，陳曉琳，邱小燕，駱志國

0 引言

近年來，我國喉癌發(fā)病率及死亡率不斷上升，已成為頭頸部最常見的惡性腫瘤之一[1]，晚期喉癌術(shù)后同期放化療的5年生存率為68.2%，單純放療的5年生存率僅為48.9%[2]。放療在喉鱗癌的治療中起到至關(guān)重要的作用[3]。放射抵抗是導(dǎo)致放療失敗的重要原因[4]。

UBE2N是泛素交聯(lián)酶E2家族的成員之一。泛素交聯(lián)酶E2家族參與泛素-蛋白酶體復(fù)合通路（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）對底物蛋白的泛素化降解[5]。泛素-蛋白酶體復(fù)合通路在調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答等方面都發(fā)揮著重要作用[6]。UBE2N是DNA損傷修復(fù)通路的成員[7]，DNA損傷后，UBE2N與泛素連接酶RNF8及RNF168結(jié)合后，促進(jìn)DNA損傷反應(yīng)中BRCA1及H2AX的泛素化修飾，從而促進(jìn)下游DNA損傷反應(yīng)的進(jìn)行[8]。研究發(fā)現(xiàn)泛素交聯(lián)酶UBE2N可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的放療敏感度[9]。本研究沉默喉鱗癌hep-2細(xì)胞中UBE2N的表達(dá)，通過CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)及克隆形成等實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證沉默UBE2N表達(dá)后對喉鱗癌細(xì)胞放射敏感度的影響，為明確UBE2N在調(diào)控喉鱗癌細(xì)胞放射敏感度中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；UBE2N siRNA沉默序列和陰性對照序列均由上海吉瑪公司合成。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購自日本TaKaRa公司；蛋白裂解液、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自南通碧云天生物技術(shù)研究所；內(nèi)參GAPDH購自蘇州GenePharma公司。GAPDH抗體、β-actin抗體、UBE2N抗體及各HRP-標(biāo)記二抗購自英國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司。Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；CCK8試劑盒購自日本同仁公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。相機(jī)購自日本Canon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人喉鱗癌hep-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 UBE2N RNA沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為UBE2N干擾組（UBE2N-siRNA）和陰性對照組（NC），UBE2N RNA沉默靶序列為：5′-AUCCAGAUGAUCCAUUAGCAATT-3′，陰性對照序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/ml，接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁生長后，按照Lipofectamine 3000說明書操作轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qPCR實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞（約1×106個），按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作提取RNA。取總RNA 2μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1min，40個循環(huán)。UBE2N引物序列為：F: 5′-GCGTTTGCTGGCAGAACCAG-3′，R: 5′-CTCAAAGGGGGAATCCTGAGGG-3′；GAPDH引物序列為：F: 5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′，R:5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計算UBE2N相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞(約1×106個)，按照試劑盒說明書操作提取蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取10 μg總蛋白用10% SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以ImagePro Plus 6.0圖像分析軟件計算灰度值，將內(nèi)參蛋白與目的蛋白兩者灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)量。

1.2.5 CCK8增殖實(shí)驗(yàn) hep-2細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染，并用0、2、4、6、8 Gy X線照射或不照射，收集細(xì)胞（約1×106個），以每孔3 000個細(xì)胞鋪到96孔板中，培養(yǎng)24、48、72和96 h后分別向?qū)?yīng)的細(xì)胞中加入CCK8，將96孔培養(yǎng)板置于37℃恒溫箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞凋亡的測定 hep-2細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染，并用0、2、4、6、8 Gy X線照射后，收集細(xì)胞（約1×106個），預(yù)冷PBS洗3次。按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.7 細(xì)胞周期的測定 hep-2細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染，并用0、2、4、6、8 Gy X線照射后，收集細(xì)胞（約1×106個），預(yù)冷PBS洗3次。70%的冷乙醇4℃固定過夜。按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書操作染色，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.8 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) hep-2細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染，收集細(xì)胞鋪到6孔板中，每孔2 000個細(xì)胞。每組3孔平行樣本。 并用0、2、4、6、8 Gy X線照射后，靜置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。14天后培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，用PBS輕輕沖洗2～3遍，1%結(jié)晶紫染色20 min，除去染色液，純水輕輕洗滌2～3遍，晾干，用相機(jī)拍照留底，在顯微鏡下計數(shù)克隆個數(shù)，≥50個的細(xì)胞團(tuán)作為一個克隆。根據(jù)克隆形成計數(shù)結(jié)果計算每組細(xì)胞克隆形成率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。以上所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，數(shù)據(jù)結(jié)果以（x±s）表示，通過配對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行計算分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE2N siRNA沉默效果檢測

轉(zhuǎn)染48 h后qPCR檢測結(jié)果顯示：UBE2N-siRNA組UBE2N mRNA表達(dá)（0.459±0.044）明顯受到抑制，與NC組（1.000）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.10, P=0.01），見圖1A。轉(zhuǎn)染72 h后Western blot結(jié)果顯示：UBE2N siRNA顯著抑制了UBE2N蛋白水平，見圖1B。上述結(jié)果表明UBE2N siRNA能夠有效抑制hep-2細(xì)胞UBE2N表達(dá)。

圖1 qPCR和Western blot法檢測siRNA沉默UBE2N后UBE2N mRNA(A)和蛋白水平(B)Figure1 UBE2N mRNA(A) and protein(B) expression detected by qPCR and Western blot after UBE2N siRNA transfection

2.2 沉默UBE2N促進(jìn)hep-2細(xì)胞增殖

CCK8檢測結(jié)果顯示：經(jīng)siRNA沉默24 h后,UBE2N-siRNA組和NC組細(xì)胞活力指數(shù)分別為（0.31±0.02）和（0.26±0.02）（P=0.042）；48 h后, 細(xì)胞活力指數(shù)分別為（0.49±0.10）和（0.29±0.02）（P=0.037）；72 h后, 細(xì)胞活力指數(shù)分別為（0.35±0.00）和（0.23±0.02）（P=0.003）；96 h后, 細(xì)胞活力指數(shù)分別為（0.27±0.03）和（0.20±0.00）（P=0.009）。說明沉默UBE2N顯著提高h(yuǎn)ep-2細(xì)胞增殖能力，見圖2。

圖2 CCK8檢測沉默UBE2N后hep-2細(xì)胞增殖情況Figure2 Effects of UBE2N silence on hep-2 cell proliferation detected by CCK8 assay

2.3 沉默UBE2N促進(jìn)輻射后hep-2細(xì)胞增殖

經(jīng)0、2、4、6、8 Gy射線照射48 h后，CCK8法結(jié)果顯示：4、6 Gy射線照射后，UBE2N-siRNA組hep-2細(xì)胞增殖能力顯著高于NC組（F4Gy=0.27,P4Gy=0.04； F6Gy=0.63, P6Gy=0.03），見圖3。提示沉默UBE2N會增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞放射抵抗。

圖3 CCK8檢測沉默UBE2N后hep-2細(xì)胞輻射后細(xì)胞增殖情況Figure3 Effect of UBE2N silence on proliferation of hep-2 cells detected by CCK8 assay after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

2.4 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)0、2、4、6、8 Gy射線照射后，NC組和UBE2N-siRNA組G1期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；未經(jīng)射線照射（0 Gy），UBE2N-siRNA組G2期細(xì)胞比例明顯高于NC組（P=0.043）；但經(jīng)2、6 Gy射線照射后，UBE2N-siRNA組G2期細(xì)胞比例明顯低于NC組（均P＜0.05）；經(jīng)0、4、6 Gy射線照射后，UBE2N-siRNA組S期細(xì)胞比例明顯高于NC組（均P＜0.05），見圖4、表1。結(jié)果表明經(jīng)輻射處理后，沉默UBE2N會促進(jìn)DNA合成，并部分解除G2阻滯，提示沉默UBE2N會增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞放射抵抗。

表1 沉默UBE2N對經(jīng)X射線處理后的hep-2細(xì)胞周期的影響Table1 Effects of UBE2N silence on cell cycle of hep-2 cells after X-ray treatment

2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

沉默UBE2N并經(jīng)0、2、4、6、8 Gy射線照射后，Annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示：UBE2N 干擾組細(xì)胞總凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡）顯著低于NC組（均P＜0.05），見圖5、表2。結(jié)果證明沉默UBE2N降低輻射誘導(dǎo)的喉鱗癌細(xì)胞凋亡。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默UBE2N基因?qū)椛浜骽ep-2細(xì)胞周期的影響Figure4 Effects of UBE2N silence on cell cycle of hep-2 cells detected by flow cytometry after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

表2 沉默UBE2N對X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響Table2 Effects of UBE2N silence on X-ray-induced cell apoptosis

2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

沉默UBE2N并經(jīng)0、2、4、6 Gy射線照射后，UBE2N-siRNA組細(xì)胞克隆形成能力顯著強(qiáng)于NC組（均P＜0.05），見圖6、表3。提示沉默UBE2N會增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞放射抵抗。

3 討論

近年研究顯示，泛素交聯(lián)酶與腫瘤放療抵抗密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)使用一種特異性抑制小分子抑制劑NSC697923抑制UBE2N后，P53及JNK通路激活，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞的增殖減慢并促進(jìn)其凋亡，故而推測UBE2N可能是這兩種腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)之一[10-11]。張喜梅等在人喉鱗癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)UBE2N在放療抵抗株hep-2R中表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞hep-2，提示泛素交聯(lián)酶UBE2N可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的放射敏感度[9]，但未做相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

細(xì)胞周期調(diào)控是決定細(xì)胞放射敏感度的一個關(guān)鍵因素。輻射誘導(dǎo)DNA損傷，使細(xì)胞周期產(chǎn)生阻滯，如G2/M期阻滯[12]，為DNA修復(fù)提供充足的時間[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中，hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染UBE2N siRNA后，其S期顯著延長，而G2期顯著縮短，增殖實(shí)驗(yàn)也表明沉默UBE2N增強(qiáng)hep-2細(xì)胞增殖，因此UBE2N調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期可能是調(diào)節(jié)放射敏感度的重要機(jī)制。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默UBE2N對輻射后hep-2細(xì)胞凋亡的影響Figure5 Effects of UBE2N silence on apoptosis of hep-2 cells detected by flow cytometry after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

細(xì)胞凋亡是影響細(xì)胞放射敏感度的重要原因，是一種潛在的放療增敏機(jī)制[14-15]，輻射可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過AnnexinV/PI雙染法證實(shí)，經(jīng)X線照射后，轉(zhuǎn)染UBE2N siRNA較轉(zhuǎn)染陰性對照NC的hep-2細(xì)胞凋亡比例明顯減少。克隆形成率是反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)X線照射后，UBE2N沉默組細(xì)胞克隆形成率顯著升高，提示沉默UBE2N能顯著降低喉鱗癌細(xì)胞群體依賴性，并增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞增殖能力。

圖6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測沉默UBE2N對輻射后hep-2細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure6 Effects of UBE2N silence on clone formation of hep-2 cells detected by clone formation assay after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

表3 沉默UBE2N對X射線處理后的細(xì)胞克隆形成能力的影響Table3 Effects of UBE2N silence on cell clone formation ability after X-ray treatment

綜上所述，UBE2N通過調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞克隆形成能力和細(xì)胞凋亡來影響喉鱗癌細(xì)胞放射抵抗。本研究在細(xì)胞水平探討了UBE2N對人喉鱗癌細(xì)胞放射抵抗的影響，但相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)和機(jī)制研究并未完成，因此，在體內(nèi)外探討UBE2N在人喉鱗癌細(xì)胞放射敏感度的機(jī)制是我們下一步需要完成的內(nèi)容，以期為喉鱗癌放療增敏提供新的可靠靶點(diǎn)。